环境微生物实验
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1、环境微生物学实验指导 目 录1. 显微镜的使用及微生物形态观察2-32 显微镜直接计数法4-53培养基的配制和灭菌6-104微生物接种技术11-135微生物大小的测定14-156水中细菌总数的检测16实验一 显微镜的使用及微生物形态观察一、 目的1.掌握显微镜的使用方法。2.通过实验学习观察微生物形态的基本方法，了解细菌、真菌和放线菌的形态特征。二、 原理微生物都是个体微小的生物，用肉眼不能看到它们的个体，所以观察它们的形态必须在显微镜下进行，另外微生物细胞具有较高的透明性，所以有些微生物（尤其是细菌和放线菌）需经过染色后才能观察清楚，细菌个体很小，其大小以微米计，所以需要在油镜下观察。放线菌
2、和霉菌的个体一般呈丝状，并且明显地分为基质菌丝和气生菌丝。成熟的个体还具有各种形态的孢子。因此观察内容包括基质菌丝、气生菌丝和孢子的形态，并注意它们的区别。三、 材料和用品1、 显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、解剖针、刀片2、 细菌和真菌玻片标本、霉菌试管培养物3、 染色液：石炭酸复红染色液 吕氏美兰染色液 乳酸石炭酸棉兰染色液四、 微生物形态观察(一) 细菌形态观察1、 将细菌示范片置于镜台上，用标本夹住。2、 在低倍镜下，调节粗调节器和细调节器，使物像清楚；然后调节推进器，使观察对象处于接物镜的正下方，调节入射光强度，使明亮度适宜，认真观察标本。最后将观察对象移至视野中心，准备在高倍镜下观
3、察。3、 将高倍接物镜头转至正下方，转换接物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相接损坏镜头。调节入射光强度，使明亮度适宜，再用调节器调至物像清楚，认真观察标本。再将观察部位移至视野中心，准备油镜观察。4、 油镜观察方法(1)用粗调节器将镜头提起约1厘米，将油镜头转至正下方。 (2)在玻片标本的镜检部位滴一滴香柏油(3)一面从侧面观察，一面用粗调节器将镜头器小心调节至几乎与标本相接触。调节时应特别小心，注意不能使镜头接触标本片，用力过猛不仅会压碎玻片，也会损坏镜头。 (4)一边从目镜观察，一边调节光线强度，使明亮度适宜；然后用细调节器校正焦距，直至能清楚地观察到物像，再认真观察，记下观察结
4、果。 (二) 真菌形态观察 1. 玻片标本观察 2. 霉菌试管培养物观察(1)于洁净的载玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉兰染色液，用解剖针从菌落的边缘处取少量带有孢子的菌丝于染液中，再细心地把菌丝挑散开，然后用盖玻片盖上，注意不要产生气泡。(2)置显微镜下观察，先在低倍镜下观察，必要是再换高倍镜观察。(3)记录观察结果。五、实验报告1、绘图说明所观察的细菌和霉菌的形态特征，并比较细菌和霉菌形态上的异同。 实验二 显微镜直接计数法一、 目的1.明确显微镜计数的原理2.学习使用血球计数板进行微生物计数的方法二、 原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。将经过适当稀释的菌悬液（或孢
5、子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。计数室的容积一定（0.1mm3），可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。此法计得的是活菌体和死菌体的总和。血球计数板有两个方格网，每个方格网共分9个大方格，中间的大方格为计数室，微生物的计数在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种为16*25型，一种为25*16型。三、 器材和用品显微镜、血球计数板、盖玻片 无菌毛细管 酿酒菌悬液四、操作步骤1. 稀释 将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。2. 镜检记数室在加样前，先对记数板的记数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能
6、进行记数。3. 加样品将清洁干燥的血球记数板盖上盖波片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进行计数室，一般进行计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。 4. 显微镜计数静止五分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5-10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌
7、体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。5. 清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水柱冲洗，洗完后晾干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。五、实验报告和思考题1.结果将结果记于下表。A表示中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。AB菌数/ml二室平均值12345第一室第二室2.思考题根据你实验的体会，说明用血球计数板的误差主要来自那些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？ 实验三 培养基的制备与灭菌一、目的学会一般培养基的制备原理、方法、掌握培养基及器皿的灭菌方法二、原理培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养
8、物配置而成的基质。其中除含有水份、碳水化合物、含氮化合物和无机盐外，有的还需要维生素。以提供微生物新陈代谢所需要的能源、碳源、N源和其它化合物，由于不同微生物对营养物质的要求不同，因此，需提供不同种类的培养基。一般培养基细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用淀粉培养基，培养霉菌常用马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基。培养基除了要满足微生物所要求的各种营养条件外，还应保证微生物所需要的其它生活条件，如适宜的酸碱度，渗透压等，因此，对不同种类的微生物，应将培养基调节到一定的pH范围，如细菌、放线菌培养基为中性；霉菌、酵母菌培养基为弱酸性。根据研究目的的不同，可以将培养基制成固体，半固体和
9、液体三种形式。固体培养基的成分与液体相同仅在液体培养基中加入凝固剂作支持物。通常加入1.52.0的琼脂，半固体加入0.30.5的琼脂作支持物，有时也可用明胶或硅胶。三、材料与用具（一） 材料：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl；1mol/L NaOH,，1mol/L HCL（二） 用具：试管、锥形瓶、漏斗、量筒、移液管、烧杯、纱布、棉花、玻璃棒、pH试纸、漏斗架、止水夹、台秤、硫酸纸、药匙、防潮纸、线绳、标签纸、剪刀、解剖刀、镊子、白瓷盘、铁丝筐。四、方法（一） 培养基的制作方法1、 称量：按照培养基的配方，准确称取各成分于烧杯中。2、 溶化：向上述烧杯中加入所需要的水量，搅动，然后加热使其溶解。
10、3、 调节pH值：用0.1N NaOH或1N HCl调至合适的范围。4、 过滤：用滤纸或双层纱布（中间夹一层脱脂棉花）趁热过滤。5、 分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管后三角瓶内，管（瓶）口塞上塞子。（1）液体：分装高度以试管高度的四分之一左右为宜；（2）固体：分装试管，每管为管高的五分之一，灭菌后制成斜面，分装三角瓶的容量以不超过三角瓶的一半为宜。（3）半固体：分装试管一般以管高的三分之一为宜。灭菌后垂直待凝成半固体深层琼脂。6、 塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉花，以阻止外界微 生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。7、 灭菌：高压蒸汽灭菌，一
