expt2--琼脂糖凝胶电泳检测DNA

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1、琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNA一、实验目的n通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术，检测质粒DNA。n带电物质在电场中的趋向运动称为电泳。n琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度nDNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应n在碱性缓冲液中DNA分子带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动二、原理n在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型n琼脂糖凝胶电泳不仅可

2、以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子n可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子，常采用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系二、原理琼脂糖凝胶浓度与线性琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分离范围参数分离范围参数 n凝胶浓度（%）线性DNA长度（bp） n 0.5 100030000 n 0.7 80012000n 1.0 50010000n 1.2 4007000n 1.5 2003000n 2.0 502000发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母本质是细菌染色体以外的遗传物质，是一种简单的，双链环状DNA分子(只有酵母的杀伤质粒是RNA质粒)，能自主复制。

3、比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。质质 粒粒双螺旋共价闭双螺旋共价闭合环（超螺旋）合环（超螺旋）开环双螺旋开环双螺旋（一个裂口）（一个裂口）线状双螺旋线状双螺旋（两个裂口）（两个裂口）细胞内：超螺旋环状共价双链细胞内：超螺旋环状共价双链DNADNA分子分子( (cccccc-DNA)-DNA) 细胞外：超螺旋细胞外：超螺旋(sc)(sc)、开环、开环( (ococ) )，线形，线形(L)(L) 在变性条件下在变性条件下, ,可成为单链可成为单链DNADNA分子（分子（ssss）质粒的存在形式质粒的存在形式n质粒DNA分子的三种构型，即CCCDNA、OCDNA和LDNA，在凝

4、胶电泳中的泳动率不同，因此电泳后呈三条带，CCCDNA泳动最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNAnEB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNAn注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套CCCDNALDNAOCDNA电泳方向三、仪器、材料与试剂n微波炉n琼脂糖凝胶电泳系统n凝胶成像系统n质粒DNAnDNA markern50TBEn6凝胶加样缓冲液(含溴酚蓝)n琼脂糖n1溴化乙锭溶液溶解琼脂糖分离质粒DNA片段检测质粒DNA片段电泳样

5、品DNA相对分子质量标准物电泳缓冲液沉淀DNA并起指示作用电泳支持介质嵌入DNA中，在紫外灯下显色四、实验步骤将1g 琼脂糖加入100ml 1TBE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到60，加入5l的1 EB，并摇匀），则为1琼脂糖凝胶液用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50）倒入，室温冷却凝固充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶0.5cm，小心垂直向上拔出梳子1. 琼脂糖凝胶的制备n用移液器吸取质粒样品5ul于手套上，再加入1l 的6加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔 n打开电源开关，调节电压至35V/cm（本实验用电压110V），可见溴酚蓝条带由负极向正极移动，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳n将凝胶置于凝胶成像系统中，打开紫外灯，DNA存在处显出荧光条带。2. 电泳CCCDNALDNAOCDNA电泳方向五、实验结果