第二章目的基因连接及导入

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1、第五节 目的基因与载体连接基因工程之基因工程之二、二、 目的基因与载体的连接（目的基因与载体的连接（接接）质粒质粒DNADNA分子分子一个一个切口切口两个两个黏性末端黏性末端两个两个切口切口获得目的基因获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种 限制酶限制酶 （主要有以下（主要有以下4 4种连接方式）种连接方式） 1) 1) 粘性末端连接粘性末端连接 2 2） 平头末端连接平头末端连接 3 3） 人工接头法人工接头法 4 4） 同源多聚尾连接法同源多聚尾连接法工工具酶：具酶：基因工程中的工具酶主要包括用于基因工程中的工具酶主要包括用

2、于DNADNA和和RNARNA分分子子的切割、的切割、连接、连接、聚合、逆聚合、逆转录等转录等相关的各种酶类。相关的各种酶类。几种重要的工具酶几种重要的工具酶 活性活性 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异碱基序列，切割识别特异碱基序列，切割DNA DNA DNA DNA连接酶连接酶 催化催化DNA5DNA5- -磷酸与磷酸与3 3- -羟基羟基 形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键 DNADNA聚合酶聚合酶 以以DNADNA为模板合成为模板合成DNA DNA 逆转录酶逆转录酶 以以RNARNA为模板合成为模板合成cDNA cDNA 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除切除5 5 末端磷酸末端磷酸T4T4

3、多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化核酸催化核酸5-5-羟基磷酸化羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶 催化催化3-3-端合成同聚尾端合成同聚尾 DNA连接酶 E. coli DNA 连接酶连接酶只能催化互补粘性只能催化互补粘性末端之间的连接末端之间的连接DNA 连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3-OH 末端与5-P末端之间形成磷酸二酯键，使末端连接。 T4 DNA 连接酶连接酶催化互补粘性末端和催化互补粘性末端和平末端之间的连接，平末端之间的连接，但平末端之间连接的但平末端之间连接的效率比较低效率比较低 。 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相

4、同粘将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过性末端，再通过DNADNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNADNA分子。分子。 用同一种或两种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点 （一）（一） 粘性末端连接粘性末端连接有些限制酶只能将目的基因和载体有些限制酶只能将目的基因和载体DNADNA切割成平端，此切割成平端，此时在时在T T4 4DNADNA连接酶连接酶的作用下同样能连接起来。的作用下同样能连接起来。 质粒产生平末端的内切酶DNA连接酶产生粘性末端的内切酶核酸酶S1目的基因

5、重组质粒核酸酶S1 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点！（二）平头末端连接（二）平头末端连接（三）（三） 人工接头法人工接头法 合成合成连接子连接子与与DNADNA平头末端连接平头末端连接限制酶切割限制酶切割, ,产生粘性末端产生粘性末端连接，构建重组连接，构建重组DNADNA。用接头连接 用同一种限制性内切酶酶切DNA连接酶重组质粒质粒目的基因+DNA连接酶接头(linker) 本法适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点！（四）同源多聚尾连接法（四）同源多聚尾连接法尾接法 DNA连接酶重组质粒质粒目的基因内切酶末端转移酶 +dGTP末端转移酶 +dCTP 本法

6、适用于在质粒和目的基因上没有相没有相同同的酶切位点基因与载体的平末端连接方法有哪些？基因与载体的平末端连接方法有哪些？(1)T4DNA连接酶法连接酶法 连接平末端连接平末端DNADNA分子的方法有分子的方法有2 2种，种，一种一种是直接用是直接用T T4 4DNADNA连接酶连接酶连接，连接，另一种另一种是先用末端核苷酸转移酶给是先用末端核苷酸转移酶给平末端平末端DNADNA分子加上同聚物尾巴之后再用分子加上同聚物尾巴之后再用DNADNA连接酶连接酶进行连接。进行连接。T T4 4DNADNA连接酶连接酶同一般的大肠杆菌同一般的大肠杆菌DNADNA连接连接酶不同。酶不同。T T4 4DNADN

7、A连接酶连接酶除了能够封闭具有除了能够封闭具有3-OH3-OH和和55-P-P末端的双链末端的双链DNADNA的缺口之外的缺口之外, ,在存在在存在ATPATP和加入高浓和加入高浓度酶的条件下度酶的条件下, ,它还能够连接具有完全配对碱基的平它还能够连接具有完全配对碱基的平末端末端DNADNA分子分子, ,但其连接效率比粘性端要低的多。但其连接效率比粘性端要低的多。（2） 同聚物加尾法同聚物加尾法 55特意的核酸外切酶处理目的基因及质粒的平特意的核酸外切酶处理目的基因及质粒的平末端，移去几个末端核苷酸。末端，移去几个末端核苷酸。运用运用末端核苷酰转末端核苷酰转移酶移酶，能够将核苷酸（通过脱氧核

8、苷三磷酸前，能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到体）加到DNADNA分子单链延伸末端的分子单链延伸末端的3-OH3-OH基因基因上上, ,它并不需要模板链的存在它并不需要模板链的存在, ,它一个一个加上它一个一个加上核苷酸核苷酸, ,构成由核苷酸组成的尾巴构成由核苷酸组成的尾巴, ,长度可达长度可达10100 0个核苷酸。个核苷酸。在载体中加入在载体中加入dTTPdTTP和末端核苷酸转移和末端核苷酸转移酶，在载体酶，在载体33OHOH末端延伸形成单链末端延伸形成单链PolyTPolyT尾巴。尾巴。将两者混合发生互补连接，缺口用将两者混合发生互补连接，缺口用DNADNA连接酶封闭。连接酶封

9、闭。3）用化学合成的衔接物连接）用化学合成的衔接物连接 DNA DNA分子用化学合成法合成一段分子用化学合成法合成一段10101212个核苷个核苷酸，具有限制酶识别位点的寡核苷酸片段，磷酸酸，具有限制酶识别位点的寡核苷酸片段，磷酸化后，通过化后，通过T4DNAT4DNA连接酶，将片段分别于载体连接酶，将片段分别于载体55端和目的基因片段端和目的基因片段55连接起来。用相应的限制连接起来。用相应的限制性内切酶处理，产生互补的粘性末端。性内切酶处理，产生互补的粘性末端。 4）T-A克隆法：克隆法： TagDNATagDNA聚合酶在扩增目的基因聚合酶在扩增目的基因DNADNA的同时，还能的同时，还能

10、不依赖模版在产物不依赖模版在产物33末端加上两个游离的末端加上两个游离的A A。只。只要载体切口除人工加上的游离要载体切口除人工加上的游离T T，PCRPCR产物即可于产物即可于载体连接。载体连接。T-A克隆克隆T-vector两条链的两条链的5端含有一个游离的端含有一个游离的TPCR过程中，普通的过程中，普通的Taq酶可在产物的酶可在产物的3端多加一个端多加一个A1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入

11、质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？防止自我环化和提高连接效率？ 目的基因片断与载体目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶由相同的单一限制性核酸内切酶（如（如EcoRI）消化酶切后）消化酶切后, 两者的两端均具有相同的粘性末两者的两端均具有相同的粘性末端端, 称为单酶切点的粘性末端称为单酶切点的