酶工程第四章.

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1、第四章第四章 固定化酶与固定化细胞固定化酶与固定化细胞v第一节第一节 概述概述v第二节第二节 固定化方法固定化方法v第三节第三节 固定化酶性质固定化酶性质v第四节第四节 固定化酶反应动力学固定化酶反应动力学v第五节第五节 固定化酶的应用固定化酶的应用一一 游离酶在应用中所存在的问题游离酶在应用中所存在的问题1 酶在水溶液中参与反应，难以回收酶，导致酶在水溶液中参与反应，难以回收酶，导致应用生产成本高，而且应用过程难于连续化；应用生产成本高，而且应用过程难于连续化；此外酶蛋白残留给产物的分离纯化带来困难。此外酶蛋白残留给产物的分离纯化带来困难。2 酶的稳定性一般较差，易受环境影响（物理酶的稳定性

2、一般较差，易受环境影响（物理因素、化学因素、生物因素），活力下降甚至因素、化学因素、生物因素），活力下降甚至失活。失活。 第一节第一节 概述概述v二固定化酶概况二固定化酶概况 定义定义:凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用的酶。的酶。 发现发现：1916年年Nelson和和Griffin，骨粉吸附转化酶，骨粉吸附转化酶 研究：研究：1953年，年，Grubhofer和和Schloith，重氮化树酯，羧，重氮化树酯，羧肽酶，淀粉酶，蛋白酶，核糖核酸酶肽酶，淀粉酶，蛋白酶，核糖核酸酶 工业化工业化：1969年千钿一郎，固定氨基酰化酶，年千钿一郎，固定

3、氨基酰化酶，D,L-氨氨基酸基酸 不溶于水不溶于水水不溶性酶，固相酶和固着酶水不溶性酶，固相酶和固着酶 1971年，第一届国际酶工程会议，年，第一届国际酶工程会议，“固定化酶固定化酶”名称名称三三 固定化酶的优缺点固定化酶的优缺点优点优点 缺点缺点重复使用重复使用 载体昂贵载体昂贵产物易于分离产物易于分离 特性会发生改变特性会发生改变稳定性提高稳定性提高 部分酶活力丧失部分酶活力丧失连续加工连续加工 辅因子再生及多酶辅因子再生及多酶 反应存在问题反应存在问题v四四 固定化菌体固定化菌体 用一定的方法对菌体或菌体碎片进行固定，直接用一定的方法对菌体或菌体碎片进行固定，直接应用菌体或菌体碎片中的酶

4、或酶系进行催化反应。应用菌体或菌体碎片中的酶或酶系进行催化反应。 五五 固定化细胞固定化细胞 定义：凡限制在一定的空间范围内，并能连续定义：凡限制在一定的空间范围内，并能连续反复地使用的能进行生命活动细胞。反复地使用的能进行生命活动细胞。五五 固定化菌体或细胞的优缺点固定化菌体或细胞的优缺点优点优点 缺点缺点省去酶分离过程省去酶分离过程 细胞内蛋白酶对细胞内蛋白酶对辅因子再生及多酶反应辅因子再生及多酶反应 所需酶的分解所需酶的分解稳定性提高稳定性提高 副产物副产物 细胞壁和膜阻碍底物细胞壁和膜阻碍底物 111111111111111和产物的渗透、扩散和产物的渗透、扩散 1973年，日本在工业上

5、成功固定化大肠年，日本在工业上成功固定化大肠杆菌菌体，利用菌体中的天门冬氨酸酶，杆菌菌体，利用菌体中的天门冬氨酸酶，连续催化反丁烯二酸为连续催化反丁烯二酸为L-天门冬氨酸。天门冬氨酸。第二节第二节 固定化方法固定化方法一固定化方法：一固定化方法：吸附法，吸附法，共价结合法，共价结合法，交联法，交联法，包埋法包埋法v二二 载体类型载体类型v1 来自于自然的有机载体来自于自然的有机载体v 优势优势:与酶有很好的相容性与酶有很好的相容性v 多糖类物质及其衍生物多糖类物质及其衍生物(多孔多孔,亲水亲水)v 纤维素及其衍生物纤维素及其衍生物(DEAE,CM)v 葡聚糖葡聚糖(Dextran)v 琼脂糖琼

6、脂糖(agarose)v 淀粉淀粉(starch)v 壳聚糖壳聚糖(chitosan)v 蛋白质蛋白质(明胶明胶gelatin ) v 2 无机载体无机载体v 优势优势:高压稳定性高压稳定性v 硅载体硅载体:多孔玻璃多孔玻璃;硅土硅土v 矿物原料矿物原料:粘土粘土,斑脱土斑脱土(火山火山灰分解成的一种粘土灰分解成的一种粘土)v3 无机合成载体无机合成载体v优势优势:化学及机械稳定性高化学及机械稳定性高v离子交换树脂离子交换树脂v 功能基团的共聚物功能基团的共聚物v三三 固定化方法固定化方法v1 吸附法吸附法:通过弱的相互作用吸附到硅土通过弱的相互作用吸附到硅土,粘土粘土,离离子交换树脂表面子交

7、换树脂表面,如离子键如离子键,氢键氢键,疏水作用力及静疏水作用力及静电等电等.1）物理吸附）物理吸附 定义：使用对蛋白质具有高度吸附能力的硅胶、定义：使用对蛋白质具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂，活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂，将酶吸附到其表面上使酶固定化的方法。将酶吸附到其表面上使酶固定化的方法。 优点：价廉，易操作易再生优点：价廉，易操作易再生 缺点：易泄漏，易受污染缺点：易泄漏，易受污染 静止法静止法 反应器上直接吸附法反应器上直接吸附法 混合浴或振荡浴吸附法混合浴或振荡浴吸附法 例：高岭士吸附胰凝乳蛋白酶例：高岭士吸附胰凝乳蛋白酶;皂土吸附过氧

8、化氢皂土吸附过氧化氢酶酶, 淀粉酶淀粉酶; 纤维素粉吸附糖苷水解酶纤维素粉吸附糖苷水解酶; 火棉胶吸附木瓜蛋白酶，碱性磷酸酶，酯酶，葡萄火棉胶吸附木瓜蛋白酶，碱性磷酸酶，酯酶，葡萄糖糖-6-磷酸脱氢酶。磷酸脱氢酶。v2）离子吸附）离子吸附 定义：酶蛋白在解离状态下因静电引力而固着定义：酶蛋白在解离状态下因静电引力而固着于带有与酶蛋白电荷相反的离子交换剂上的固定于带有与酶蛋白电荷相反的离子交换剂上的固定化方法。化方法。 主要缺点：离子强度增加或者介质主要缺点：离子强度增加或者介质pH， 温度改温度改变时，离子吸附不稳定，酶与载体解离。变时，离子吸附不稳定，酶与载体解离。v 3）疏水吸附）疏水吸附

9、 N烷基（疏水）琼脂糖烷基（疏水）琼脂糖 黄嘌呤氧化酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酯酶、脲酶（疏水黄嘌呤氧化酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酯酶、脲酶（疏水性强）。性强）。v 4）亲和吸附）亲和吸附 伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A （利用此蛋白与糖蛋白的专一性结合）（利用此蛋白与糖蛋白的专一性结合）琼脂糖吸附糖蛋白。琼脂糖吸附糖蛋白。 5）螯合吸附）螯合吸附 利用酶蛋白上的金属离子与载体基团的螯合吸附。利用酶蛋白上的金属离子与载体基团的螯合吸附。v2 包埋法包埋法v1）定义：将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透）定义：将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法。膜微胶囊中的方法。 该方法不需要化学修饰，反应条件温

10、和，适合该方法不需要化学修饰，反应条件温和，适合大多数酶，粗酶制剂，甚至完整的微生物细胞。大多数酶，粗酶制剂，甚至完整的微生物细胞。v2）根据载体材料和方法的不同，可分为格子）根据载体材料和方法的不同，可分为格子型包埋法和微胶囊法。型包埋法和微胶囊法。 格子型包埋法格子型包埋法 常用凝胶：聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，海藻酸钙凝胶，常用凝胶：聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶，明胶等。角叉菜胶，明胶等。 为防止包埋固定化后酶从凝胶中泄漏出来，凝胶孔径应控为防止包埋固定化后酶从凝胶中泄漏出来，凝胶孔径应控制在小于酶分子直径的范围内。因而对于大分子底物的进制在小于酶分子直径的范围内。

11、因而对于大分子底物的进入和大分子产物的扩散出去不利。入和大分子产物的扩散出去不利。v微胶囊法（半透膜包埋法）微胶囊法（半透膜包埋法） 定义：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的半透定义：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的半透性小球内，制成固定化酶。性小球内，制成固定化酶。 小球直径一般只有几微米至几百微米，称为微胶囊。小球直径一般只有几微米至几百微米，称为微胶囊。v3 共价法共价法 定义：通过共价键将酶与载体结合的固定化定义：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。方法。 优点；稳定性好优点；稳定性好 缺点：反应条件激烈，操作复杂，控制条件缺点：反应条件激烈，操作复杂，控制条件 苛刻，相对酶活力较