细胞培养及材料细胞毒性检测

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1、前言细胞培养的基本概念细胞培养的基本条件细胞培养的基本方法细胞培养的污染和检测细胞冻存和复苏细胞管理及保藏细胞毒性检测 Wilhelm Roux (1850-1924 ) 1885年年Roux最早尝试使组最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。并首次采用组织培养这个术语。1.1.前言前言Alexis CarrelFranceRockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USAb. 1873d. 1944 1907年年Harr

2、ison 和和1912年年Carrel开始把组织培养作为一开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细种方法，用于研究离体动物细胞的培养。胞的培养。 他建立的鸡胚胎成纤维细胞他建立的鸡胚胎成纤维细胞持续了持续了34年之久年之久(1912-1946) 器官培养 (Organ culture)：将活体中整个器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小片组织（O.51立方毫米）置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。细胞培养(cell culture)：把提取的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，后进行培养

3、，增殖。肿瘤肿瘤胚胎胚胎成体成体粗切粗切消化消化细切细切修切修切细胞培养细胞培养 组织培养组织培养器官培养器官培养活细胞活细胞便于观察检测便于观察检测条件可控条件可控均一性均一性便于人工筛选便于人工筛选失去原有组织结构和形态，趋向单一性失去原有组织结构和形态，趋向单一性分化减弱分化减弱可能获得不死性可能获得不死性贴壁型：动物的正常细胞贴壁型：动物的正常细胞悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞固定化培养固定化培养来源：由来源：由中胚层间充质组织起源中胚层间充质组织起源的组织的组织 如：真正的成纤维细胞如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细

4、胞心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞形态：形态：似体内成纤维细胞似体内成纤维细胞的形态的形态 胞体梭形胞体梭形或不规则三角形或不规则三角形 胞质向外伸出胞质向外伸出23个个长短不等的突起长短不等的突起 中有卵圆形核中有卵圆形核 生长特点：生长特点： 排列成排列成放射状放射状，漩涡状，漩涡状 并不紧靠连成片并不紧靠连成片， 细胞细胞细胞接触易断开而细胞接触易断开而单独行动单独行动 原代细胞：从机体取出后立即培养原代细胞：从机体取出后立即培养的细胞的细胞原代培养：将从体内取出的细胞进原代培养：将从体内取出的细胞进行培养行培养传代培养：从原代培养细胞继续转传代培养：从原代培养细胞继续转接培养接培养传代

5、细胞：在体外培养条件下持续传代细胞：在体外培养条件下持续传代培养的细胞传代培养的细胞无菌无菌无毒、生物相容性无毒、生物相容性清洁的环境清洁的环境品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品和去离子水和去离子水有标准化的工作方法有标准化的工作方法 培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确，培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等否和制备日期等一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重

6、要的是：培养用品与非培养用品应严格其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放分开，已消毒品与未消毒品应分别存放无菌条件无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工超净工作台作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素器，抗生素细胞生长条件细胞生长条件：培养板，培养瓶，：培养板，培养瓶，CO2培养箱培养箱，培养基，血清培养基，血清细胞检测条件细胞检测条件：倒置显微镜倒置显微镜，酶标仪，微孔板，酶标仪，微孔板震荡器，高速

7、离心机，移液器震荡器，高速离心机，移液器细胞保存条件细胞保存条件：液氮罐，超低温冰箱：液氮罐，超低温冰箱超净工作台高压蒸汽灭菌器过滤除菌装置倒置显微镜水纯化装置恒温培养箱电热干燥箱离心机、天平、水浴、摇床液氮罐冰箱：4、-20 、-80 移液器移液器移液管移液管吸管吸管培养瓶：培养瓶： 25cm25cm2 2、75cm75cm2 2、150cm150cm2 2培养皿：培养皿： 3030、6060、120120毫米毫米多孔培养板：多孔培养板： 4 4、6 6、2424、9696孔孔离心管离心管冻存管冻存管基础培养基 8095血清 520青、链霉素 各100Uml天然培养基： 血清 血浆 组织提取

8、液（如鸡胚和牛胚浸液） 合成培养基： 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM、人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 马血清等优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、 病毒污染。血清的灭活（消除补体活性） 56 ，30 分钟。血清的消毒：过滤除菌其他细胞培养用液n水：新鲜的三蒸水或去离子水n平衡盐溶液 主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用：维持渗透压

9、、缓冲和调节酸碱度 常用的缓冲液： 生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）n通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。n配制 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万U。 n使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最终为100U/ml。n庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。主要作用： 水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。常用浓度：0.25% 用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank

10、s配制，用滤器过滤除菌。消化时间： 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。 物物 品品湿湿 热热干干 热热过过 滤滤紫紫 外外化学化学气体气体消毒剂消毒剂电离电离辐射辐射培养室培养室工作台工作台玻璃玻璃制品制品金属金属器械器械塑料塑料制品制品橡胶橡胶制品制品培养培养用液用液布类布类棉类棉类 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。粘着、粘附粘着、粘附（attachment）铺展铺展（spreading)1）取材）取材 切割切割组织块培养法组织块培养法消化培养法消化培养法2）直接购买）直接购买 培养培养（原代培养）