临床基因扩增实验室室内质控

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1、存在的问题存在的问题l概念不清l不知道具体怎么做l不会写室内质控的SOPl不知道如何选择室内质控物l不会分析室内质控的结果第二页，共53页。室内质控室内质控SOP存在的问题存在的问题l责任人不清。l质控物的来源及浓度不清或不全，并且通常没有说明阴性质控物的来源。有些是自制，但制备方法不规范，没有任何的质量检验，定量结果没有溯源性。l没有明确所选用的质控方法。对前20次的测定的室内质控没有解决方法。l没有明确的失控判断标准，只是做了一些失控的含糊叙述。并且一般都没有阴性失控的判断方法。l没有失控后的分析及处理措施。 第三页，共53页。室内质量控制（室内质量控制（Internal Quality

2、Control,IQC)的概念的概念l由由实验室工作人员实验室工作人员，采取一定的方法和步骤，连，采取一定的方法和步骤，连续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在续评价本实验室工作的可靠性程度，旨在监测和监测和控制本实验室工作的精密度控制本实验室工作的精密度，提高本室常规工作，提高本室常规工作中批内、批间样本检验的一致性，以中批内、批间样本检验的一致性，以确定测定结确定测定结果是否可靠、可否发出报告的一项工作果是否可靠、可否发出报告的一项工作。l可概括为可概括为: :(1)(1)执行者执行者：实验室技术人员；：实验室技术人员；(2)(2)目的目的：监测实验室测定的重复性；监测实验室测定的重复性；(

3、3)(3)功能功能：决定了当批：决定了当批测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定测定的有效性，报告可否发出。是对实验室测定的的即时性评价即时性评价。 第四页，共53页。室内质量控制（室内质量控制（IQC）的基本内容）的基本内容l主要包括三个方面：（1）测定前的质量控制；（2）统计学质量控制；（3）质量控制的评价。第五页，共53页。测定前的质量控制l实验室设施、仪器设备及管理l理想的试剂和操作方法 l人员培训 第六页，共53页。实验室设施、仪器设备及管理实验室设施、仪器设备及管理l实验室空间及工作流程的设计l实验室环境条件的控制：温湿度控制设备、稳压或不间断电源第七页，共53页。理想的理想的

4、PCR实验室设计实验室设计A产物分析区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区第八页，共53页。产物分析区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区理想的理想的PCR实验室设计实验室设计B第九页，共53页。临床PCR实验室设计的一般原则l各区独立l注意风向l因地制宜l方便工作“十六字口诀十六字

5、口诀”第十页，共53页。产物分析区产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊专用走廊工作流向工作流向扩增区扩增区标本制备区标本制备区试剂准备区试剂准备区传递窗传递窗传递窗第十一页，共53页。临床临床PCR实验室质量管理的特点实验室质量管理的特点 l“无基因”概念 l实验室要有严格的人员进入限制和程序 l使用合格的试剂和消耗品 第十二页，共53页。PCR实验室实验室“污染污染”的主要来的主要来源源l临床标本中存在的大量待测微生物l科研中得到的质粒克隆l以前分析研究的特定微生物l大量存在于实验环境中的特定微生物l以前扩增产

6、物的残留污染。这也是PCR实验室最容易产生的将造成假阳性的“污染”。 第十三页，共53页。PCR实验室的重要防实验室的重要防“污染污染”措施措施l实验室的严格分区及工作程序的严格遵守 l化学方法：实验台面可使用10的次氯酸钠（漂白剂）清洗 ；有些物品比如放置扩增反应管的盘必须从污染区转回到清洁区时，在转回之前，应将其置于210的次氯酸钠溶液中过夜，并充分冲洗。l紫外照射：实验台面、仪器设备、实验室空间lUNG第十四页，共53页。仪器设备及管理仪器设备及管理lPCR仪、离心机、加样器、恒温设备等应建立技术档案，并定期维护;PCR仪、加样器、恒温设备应定期进行校准第十五页，共53页。理想的试剂理想

7、的试剂:试剂的质检试剂的质检l核酸提取或标本处理方法的抗干扰能力（能否 有效地去掉PCR抑制物）l测定下限(Detection limit)（定性测定）l测定准确性和线性范围l批内变异和批间变异l试剂批间的一致性l有否污染l其他：外包装、试剂的完整性、有效期、说明书等第十六页，共53页。理想的操作方法l按照试剂盒说明书操作即可吗?l操作中影响测定结果的关键环节l写出具有可操作性的SOP第十七页，共53页。人员培训人员培训l培训所涉及的范围:仪器设备使用、维护和校准；试剂、方法原理；质量管理体系；相关法律法规、相关领域的新技术、新理念和新进展；实验操作技能等。l如何培训：讲座、讨论、自学和参加培

8、训班等。l培训的评估：书面考试、实验考核、讨论心得、论文、综述等。第十八页，共53页。统计质控方法l质控物浓度的选择l每次（批）测定质控物的数量及放置l质控规则lLevey-Jennings质控图方法 l“即刻法”质控方法 l“假阳性”的统计质控方法第十九页，共53页。质控物浓度的选择质控物浓度的选择l定量测定：测定线性范围内的高、中、低三种浓度l定性测定：接近方法测定下限的浓度l阴性质控物第二十页，共53页。每次（批）测定质控物的数量及放每次（批）测定质控物的数量及放置置l标本数量如小于30，弱阳性和阴性质控各1份，标本数量增加，质控物数量相应按比例增加l均匀分散于临床标本中，与临床标本一同

9、处理（核酸提取）l扩增时的排列顺序，可排于标准品或校准品之后，临床样本之前。但在扩增仪中的位置，不应永久性的固定的在一个孔，而应在每次扩增检测时，进行相应的顺延，以使在一定的时间内，可以尽可能的监测每一个孔的扩增有效性。第二十一页，共53页。阴性质控样本的种类阴性质控样本的种类l阴性原血清样本l实验过程中带入的空管l仅含扩增反应混合液的管第二十二页，共53页。阴性原血清样本的功能阴性原血清样本的功能l监测实验室的以前扩增产物的“污染”l由实验操作所致的标本间的交叉污染。具体地说，如强阳性标本气溶胶经加样器所致的污染、强阳性标本经操作者的手所致的污染、使用翻盖离心管核酸提取时在较高温孵育时盖子崩

10、开等l扩增反应试剂的污染。 第二十三页，共53页。核酸提取过程中带入的空管核酸提取过程中带入的空管l监测核酸提取过程中的实验室“污染”的存在（在整个实验过程中，开口放置于核酸提取的操作台面区域内，最后以水为基质，进行扩增 ）第二十四页，共53页。仅含扩增反应混合液的管仅含扩增反应混合液的管l监测试剂的“污染”第二十五页，共53页。质控规则的表达方式及定义 l质控规则的表达方式 l质控规则的功能 l常用质控规则的符号及定义 第二十六页，共53页。质控规则的表达方式l通常质控规则以符号AL来表示，其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数，L为控制限，通常用均值或均值13SD来表示。 l当质控

11、测定值超出控制限L时，即可将该批测定判为失控。 l常用的13S质控规则，其中1为原式中的A，3s为原式中的L，表示均值3s，其确切的含义为：在质控测定值中，如果有一个测定值超出均值3s范围，即可将该批测定判为失控。 第二十七页，共53页。质控规则的功能 l简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控。第二十八页，共53页。常用质控规则的符号及定义 符符 号号 定定 义义l12S 一个质控测定值超出2s控制限。l13S 一个质控测定值超出3s控制限。l22S 两个连续的质控测定值同时超出+2s或2s控制限。lR4S 同一批测定中，两个不同浓度质控物的测定值之间的 差值超出4s控制限。l41S 四个连