第六节-双脱氧末端终止测序法原理_过程和目标基因cDNA序列拼接和分析

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1、1双脱氧末端终止法测序的原理、双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目标基因序列的分析过程和目标基因序列的分析2 DNA测序技术主要有两种方法，都是在测序技术主要有两种方法，都是在20世世纪纪70年代中期发明的。年代中期发明的。 A. 双脱氧链终止法双脱氧链终止法（the chain termination method），是通过），是通过合成合成与单链与单链DNA互补的多核苷互补的多核苷酸链来读取待测酸链来读取待测DNA分子的顺序分子的顺序。 B. 化学降解法化学降解法（chemical degradation method），），是将双链是将双链DNA分子用化学试剂处理，分子用化学试剂处理，产

2、生切口产生切口，用同位素标记进行测序。用同位素标记进行测序。一、一、DNA测序的方法测序的方法31. Sanger双脱氧链终止法测序原理双脱氧链终止法测序原理 利用利用DNA聚合酶和聚合酶和双脱氧链终止物测定双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家学实验室的生物化学家F. Sanger等人于等人于1977年年发明的。发明的。4基本原理：基本原理： 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的区分长度只差一个核苷酸的DNA分子；分子； 利用利用DNA聚合酶不能够区聚合酶不能够区分分dNTP和和

3、ddNTP的特性，的特性，使使ddNTP参入到寡核苷酸链参入到寡核苷酸链的的3-末端。因为末端。因为ddNTP 3不不是是-OH，不能与下一个核苷，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。链的增长。562、具体操作：具体操作： 测序时分成四个反应测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外每个反应除上述成分外分别加入分别加入2,3-双脱氧的双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称核苷三磷酸（称为为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚然后进行聚合反应。在第一个反应中合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替会随机地代替dATP参

4、加反应，一旦参加反应，一旦ddATP加入了新合成的加入了新合成的DNA链，由于其第链，由于其第3位的位的-OH变成了变成了-H, 所以不能所以不能继续延伸继续延伸,于是第一个反应中所产生的于是第一个反应中所产生的DNA链都是链都是到到A就终止了。就终止了。7 同理第二个反应产生的都是以同理第二个反应产生的都是以C结结尾的尾的; 第三个反应的都以第三个反应的都以G结尾结尾, 第四个第四个反应的都以反应的都以T结尾结尾, 电泳后就可以读出序电泳后就可以读出序列了列了.8 假如有一个假如有一个DNA, DNA, 互补序列是互补序列是GATCCGAT, GATCCGAT, 我们试着做一下我们试着做一下

5、: : 在第一个反应中由于含有在第一个反应中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到所以遇到G, T, C三个碱基时没什么问题三个碱基时没什么问题, 但遇到但遇到A时时, 掺入的可能是掺入的可能是dATP或或ddATP, 比如已合成到比如已合成到G, 下一个如果参与反应的是下一个如果参与反应的是ddATP则终则终止止, 产生一个仅有产生一个仅有2个核苷酸的序列个核苷酸的序列: GA, 否则继续延伸否则继续延伸, 可以可以产生序列产生序列GATCCG, 又到了下一个又到了下一个A了了. 同样有两种情况同样有两种情况, 如果如果是是ddATP掺入掺入, 则产生的序列是则产生的序列是GATCCG