七叶亭对巨噬细胞株TNF―α、IL―6和NF―κB影响的实验研究.doc
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2022-07-01 17:57:29上传
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七叶亭对巨噬细胞株TNF―α、IL―6和NF―κB影响的实验研究
【摘 要】目的:探索七叶亭(Esculetin)对巨噬细胞株RAW264.7细胞活性及分泌炎性因子TNF-α、IL-6和NF-κB表达的影响。方法:分别加入12.5、25、50μM的Esculetin与巨噬细胞RAW264.7共培养24h后,MTT观察不同浓度Esculetin对细胞活力的影响; ELISA检测上清液中TNF-α、IL-6含量;Western blot检测NF-κB的表达。结果:不同浓度的Esculetin对RAW264.7活力无明显影响;不同浓度的Esculetin可抑制巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6,浓度越高,抑制作用越强;Esculetin抑制NF-κB蛋白的活化作用随浓度变化而不同,25μM和50μM对NF-κB活化的抑制作用最强。结论: Esculetin对巨噬细胞株RAW264.7的活力无明显影响;Esculetin能抑制炎性因子TNF-α、IL-6的分泌,并呈剂量依赖关系;能抑制NF-κB蛋白的活化。其发挥抗炎作用有可能是依赖NF-κB信号通路而完成的。
【关键词】七叶亭;巨噬细胞;TNF-α;IL-6;NF-κB
【中图分类号】R 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2012)12-0013-03
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是缺血性心脑血管病的病理基础,心脑血管病发病率与死亡率近年也明显增加。AS具有慢性炎症反应特征的病理过程[1],而且AS从粥样硬化斑块形成到斑块破裂,导致血栓形成的各个阶段,都有炎症细胞和炎症介质参与。本研究用七叶亭(Esculetin)作用于巨噬细胞 RAW264.7,观察巨噬细胞活性、分泌TNF-α、IL-6以及对NF-κB活化的影响,探讨七叶亭抑制炎症反应-抗动脉粥样硬化的可能机制。
1 材料与方法
1.1 细胞株 小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自中科院上海细胞生物学研究所
1.2 实验试剂 七叶亭( Alfa公司),MTT ( Sigma公司 ),胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司),DMEM培养基(南京凯基生物工程有限公司),小鼠TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),兔抗NF-κB p65,p-NF-κB p-p65抗体(Cell signaling公司),β-actin蛋白多克隆一抗,山羊抗兔二抗,马抗小鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.3 主要仪器与设备
低温高速离心机(中国科大创新股份有限公司),电热恒温水浴箱(北京医疗设备厂),Olympus荧光倒置显微镜(日本Olympus公司),酶标仪Bio-Rad 550(美国伯乐公司),微型高速离心机(珠江黑马医学仪器有限公司),-80℃超低温冰箱、超净工作台(美国Forma公司),CO2培养箱(香港力康Heal force公司),微量加液器(芬兰Biohit公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞活性的 MTT检测
(1)接种细胞:用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化液将培养的第3代RAW264.7细胞从细胞培养瓶壁消化下来,再用含10%胎牛血清培养基配成单细胞悬液,调细胞密度2.5×104个/mL,每孔200μL,接种在96孔板中;(2)实验分组:空白对照组,Esculetin12.5μM,Esculetin25μM,Esculetin50μM(见表1)。每组设4个复孔;(3)细胞培养:37℃、5% CO2条件下培养,24h后换无血清DMEM培养液,继续孵育24 h后加入药物干预24h;(4)呈色:分别于药物作用结束前4h,每孔加5mg?mL- 1 MTT 20μL,4h后终止培养,吸弃孔内上清液,每孔加150μL二***亚砜(DMSO),振荡10min使结晶充分溶解;(5)比色:在酶标仪上490 nm波长处测定吸光度。
1.4.2 巨噬细胞 RAW264.7分泌TNF-α、IL-6的检测
用含10%胎牛血清培养基培养RAW264.7细胞,细胞长满瓶底80%时,弃去培养基,加PBS液漂洗 2次;加入含胰酶和EDTA的消化液1-2ml,37℃消化约2min,镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化;弃消化液加PBS液漂洗 2次,加入新培养液10 ml,反复吹打混悬细胞,细胞密度调整为1×55/ml;以每孔 1ml细胞悬液将细胞接种到6孔板,每孔再加培养基4ml;然后将6孔板放入 5%CO2孵箱37℃培养24h,待细胞长满瓶底80%时(见图1),弃去上清液,分别加入终浓度为0(空白对照),12.5μM,25μM,50μM的含药培养基DMEM, 继续培养24h。收集每
【摘 要】目的:探索七叶亭(Esculetin)对巨噬细胞株RAW264.7细胞活性及分泌炎性因子TNF-α、IL-6和NF-κB表达的影响。方法:分别加入12.5、25、50μM的Esculetin与巨噬细胞RAW264.7共培养24h后,MTT观察不同浓度Esculetin对细胞活力的影响; ELISA检测上清液中TNF-α、IL-6含量;Western blot检测NF-κB的表达。结果:不同浓度的Esculetin对RAW264.7活力无明显影响;不同浓度的Esculetin可抑制巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6,浓度越高,抑制作用越强;Esculetin抑制NF-κB蛋白的活化作用随浓度变化而不同,25μM和50μM对NF-κB活化的抑制作用最强。结论: Esculetin对巨噬细胞株RAW264.7的活力无明显影响;Esculetin能抑制炎性因子TNF-α、IL-6的分泌,并呈剂量依赖关系;能抑制NF-κB蛋白的活化。其发挥抗炎作用有可能是依赖NF-κB信号通路而完成的。
【关键词】七叶亭;巨噬细胞;TNF-α;IL-6;NF-κB
【中图分类号】R 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2012)12-0013-03
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是缺血性心脑血管病的病理基础,心脑血管病发病率与死亡率近年也明显增加。AS具有慢性炎症反应特征的病理过程[1],而且AS从粥样硬化斑块形成到斑块破裂,导致血栓形成的各个阶段,都有炎症细胞和炎症介质参与。本研究用七叶亭(Esculetin)作用于巨噬细胞 RAW264.7,观察巨噬细胞活性、分泌TNF-α、IL-6以及对NF-κB活化的影响,探讨七叶亭抑制炎症反应-抗动脉粥样硬化的可能机制。
1 材料与方法
1.1 细胞株 小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自中科院上海细胞生物学研究所
1.2 实验试剂 七叶亭( Alfa公司),MTT ( Sigma公司 ),胎牛血清(杭州四季青生物材料有限公司),DMEM培养基(南京凯基生物工程有限公司),小鼠TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),兔抗NF-κB p65,p-NF-κB p-p65抗体(Cell signaling公司),β-actin蛋白多克隆一抗,山羊抗兔二抗,马抗小鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.3 主要仪器与设备
低温高速离心机(中国科大创新股份有限公司),电热恒温水浴箱(北京医疗设备厂),Olympus荧光倒置显微镜(日本Olympus公司),酶标仪Bio-Rad 550(美国伯乐公司),微型高速离心机(珠江黑马医学仪器有限公司),-80℃超低温冰箱、超净工作台(美国Forma公司),CO2培养箱(香港力康Heal force公司),微量加液器(芬兰Biohit公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞活性的 MTT检测
(1)接种细胞:用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化液将培养的第3代RAW264.7细胞从细胞培养瓶壁消化下来,再用含10%胎牛血清培养基配成单细胞悬液,调细胞密度2.5×104个/mL,每孔200μL,接种在96孔板中;(2)实验分组:空白对照组,Esculetin12.5μM,Esculetin25μM,Esculetin50μM(见表1)。每组设4个复孔;(3)细胞培养:37℃、5% CO2条件下培养,24h后换无血清DMEM培养液,继续孵育24 h后加入药物干预24h;(4)呈色:分别于药物作用结束前4h,每孔加5mg?mL- 1 MTT 20μL,4h后终止培养,吸弃孔内上清液,每孔加150μL二***亚砜(DMSO),振荡10min使结晶充分溶解;(5)比色:在酶标仪上490 nm波长处测定吸光度。
1.4.2 巨噬细胞 RAW264.7分泌TNF-α、IL-6的检测
用含10%胎牛血清培养基培养RAW264.7细胞,细胞长满瓶底80%时,弃去培养基,加PBS液漂洗 2次;加入含胰酶和EDTA的消化液1-2ml,37℃消化约2min,镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化;弃消化液加PBS液漂洗 2次,加入新培养液10 ml,反复吹打混悬细胞,细胞密度调整为1×55/ml;以每孔 1ml细胞悬液将细胞接种到6孔板,每孔再加培养基4ml;然后将6孔板放入 5%CO2孵箱37℃培养24h,待细胞长满瓶底80%时(见图1),弃去上清液,分别加入终浓度为0(空白对照),12.5μM,25μM,50μM的含药培养基DMEM, 继续培养24h。收集每
七叶亭对巨噬细胞株TNF―α、IL―6和NF―κB影响的实验研究
