第三章_微载体培养技术

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1、一、何谓微载体？一、何谓微载体？指直径指直径60-250m60-250m，能适用于贴壁细胞生长的，能适用于贴壁细胞生长的微珠。微珠。一般是由一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成成。第三章第三章 微载体培养技术微载体培养技术（microcarrier culture techniquemicrocarrier culture technique） 最初采用在培养液中加入一定数量的小滚瓶，最初采用在培养液中加入一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的贴壁面积。增加细胞生长的贴壁面积。此方法构造简单，成本低，重复性好，放此方法构造简单，成本低，重复性好，放大过程可依靠滚

2、瓶数量的增加。大过程可依靠滚瓶数量的增加。但产率低，劳动强度大，占空间大但产率低，劳动强度大，占空间大。如何增加细胞生长的贴壁面积？如何增加细胞生长的贴壁面积？微载体系统微载体系统 19671967年被用于动物细胞大规模培养。年被用于动物细胞大规模培养。 兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。 现广泛用于培养各类细胞，生产疫苗、蛋白质产现广泛用于培养各类细胞，生产疫苗、蛋白质产品。品。微载体培微载体培养系统养系统培养培养4h4h，微载体间的细，微载体间的细胞胞“桥联桥联” ” 200200 电镜下串在一起的电镜下串在一起的肝细胞微载体肝细胞微载体730

3、 730 由于肝细胞的粘附作用微载由于肝细胞的粘附作用微载体形成体形成“串珠串珠” ” 400400 脊髓灰质炎、狂脊髓灰质炎、狂犬和乙脑等疫苗犬和乙脑等疫苗二、微载体的商品类型二、微载体的商品类型第一种微载体第一种微载体： Van WezelVan Wezel用用DEAE-Sephadex A50DEAE-Sephadex A50研制而来研制而来市售（国际）种类有十几种以上：市售（国际）种类有十几种以上：液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMAPHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐

4、凝胶微载体以及磁性微载体等体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等常用商品化微载体有三种：常用商品化微载体有三种： Cytodex1 Cytodex1、2 2、3 3，CytoporeCytopore和和CytolineCytoline显微镜下的高密度微载体显微镜下的高密度微载体l优良的微载体应具有的特性优良的微载体应具有的特性价廉价廉，能，能重复重复使用。使用。不含不含能能毒害毒害细胞细胞的的成分成分；微载体须微载体须与细胞有良好的相容性与细胞有良好的相容性；密度密度应应略大于培养基略大于培养基；粒径粒径在在4040120120m m范围，生理盐水溶胀后增大到范围，生理盐水溶胀后增大到60602

5、50 250 m m，粒度分布地均匀，径差不大于，粒度分布地均匀，径差不大于20202525m m；良好的良好的光学透明性光学透明性；能在能在PBSPBS中中耐耐120120125125、202030min30min高温灭菌高温灭菌；应是应是非刚性材料非刚性材料；不吸收不吸收培养基中的培养基中的营养成分营养成分；收获收获细胞或细胞制品细胞或细胞制品容易容易，不影响蛋白质分离纯化不影响蛋白质分离纯化；三、微载体培养原理与操作三、微载体培养原理与操作 1 1、原理：、原理：将对细胞无害的颗粒将对细胞无害的颗粒微载体加入到培养容器的微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细培养液中，作为载体，使

6、细胞在微载体表面附着生长，胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。始终保持悬浮状态。 丝网丝网微载体微载体通气的培养基通气的培养基鼓泡器鼓泡器搅拌叶轮搅拌叶轮微载体培养装置图微载体培养装置图微载体的大小微载体的大小：增大单位体积内表面积增大单位体积内表面积（S/FS/F）对细胞的生长非常有利。使微载体直）对细胞的生长非常有利。使微载体直径尽可能小，最好控制在径尽可能小，最好控制在100-200m100-200m之间。之间。 微载体的密度微载体的密度：一般为一般为1.03-1.05g/cm1.03-1.05g/cm2 2，随着细胞的贴附及生长，密

7、度可逐渐增大。随着细胞的贴附及生长，密度可逐渐增大。 微载体的表面电荷微载体的表面电荷：据研究，控制细胞据研究，控制细胞贴壁的基本因素贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质是电荷密度而不是电荷性质。若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷若电荷密度太低，细胞贴附不充分，但电荷密度过大，反而会产生密度过大，反而会产生“毒性毒性”效应。效应。 细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的细胞能否黏附，主要取决于细胞与微载体的接接触概率和相融性触概率和相融性。 细胞细胞增殖阶段：增殖阶段：黏附贴壁、生长和扩展成单层；黏附贴壁、生长和扩展成单层；贴壁依赖性细胞在微载体表面上：贴壁依赖性细胞在微载体表面上：贴附

8、是进一步铺展和生长的关键，贴附是进一步铺展和生长的关键，主要是靠静主要是靠静电引力和范德华力；电引力和范德华力；VeroVero细胞在细胞在Cytodex-3Cytodex-3微载体表面粘附铺展的形貌变化微载体表面粘附铺展的形貌变化通常做法：通常做法：贴壁期采用低搅拌转速，时搅贴壁期采用低搅拌转速，时搅时停时停；数小时后，待细胞附着于微载体表；数小时后，待细胞附着于微载体表面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。面时，维持设定的低转速，进入培养阶段。微载体培养的搅拌非常慢微载体培养的搅拌非常慢，最大速度，最大速度75r/min75r/min。 2 2、搅拌转速：、搅拌转速：动物细胞无细胞壁，对剪

9、切力敏感，动物细胞无细胞壁，对剪切力敏感，。搅拌速率越大，制得的微球越小，搅拌速率越大，制得的微球越小，聚合物浓度越大，制得的微球较大聚合物浓度越大，制得的微球较大以聚己内酯（以聚己内酯（PCLPCL）、聚左旋乳酸（）、聚左旋乳酸（PLLAPLLA）、聚乙醇酸）、聚乙醇酸聚乳酸共聚物（聚乳酸共聚物（PGLAPGLA）为基质制备可生物降解微载体）为基质制备可生物降解微载体 3 3、细胞与微载体的相融性：、细胞与微载体的相融性： 与与微载体表面理化性质微载体表面理化性质有关。一般细胞有关。一般细胞在进入生理在进入生理pHpH值时，表面带负电荷。若微值时，表面带负电荷。若微载体带正电荷，则利用载体带

10、正电荷，则利用静电引力静电引力可加快细可加快细胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电胞贴壁速度。若微载体带负电荷，因静电斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶斥力使细胞难于黏附贴壁，但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时，则带负电荷的细胞也能贴附。介时，则带负电荷的细胞也能贴附。 (a)MCC(a)MCC细胞，未经处理的细胞，未经处理的Cytodex-3Cytodex-3表面；表面；(b)MCC(b)MCC细胞，用纤粘连蛋细胞，用纤粘连蛋白处理后的白处理后的Cytodex-3Cytodex-3表面表面 (c)Vero(c)Vero细胞，未经处理的细

11、胞，未经处理的Cytodex-3Cytodex-3表面；表面； (d) Vero(d) Vero细胞，用层粘连蛋白处理的细胞，用层粘连蛋白处理的Cytodex-3Cytodex-3表面表面(e) Vero(e) Vero细胞，细胞，用纤粘连蛋白处理的用纤粘连蛋白处理的Cytodex-3Cytodex-3表面表面细胞（细胞（VeroVero和和MCCMCC）在不同外源基质处理的（）在不同外源基质处理的（Cytodex-3Cytodex-3）微载体上贴附）微载体上贴附 4 4、细胞在微载体表面的生长的影响因素、细胞在微载体表面的生长的影响因素 l 细胞方面：细胞方面：细胞群体、状态和类型。细胞群体