第三章 高效液相色谱法.

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1、13.1 概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术(不挥发有机物约占70% )，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较： 2高效液相色谱仪高效液相色谱仪主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n） 分析周期长

2、 无法在线检测2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H，n） 分析时间大大缩短 可以在线检测4l 离线分析在时间上有滞后性，得到的是历史性分析数据，而在线分析得到的是实时的分析数据，能真实地反映生产过程的变化，通过反馈线路，可立即用于生产过程的控制和最优化。离线分析通常只是用于产品（包括中间产品）质量的检验，而在线分析可以进行全程质量控制，保证整个生产过程最优化。在线分析是今后生产过程控制分析的发展方向。 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1分析对象分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且

3、沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%2流动相差别流动相差别vGC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 vHPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性3操作条件差别操作

4、条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）7人参人参Ginseng8人参、西洋参与三七的鉴别min1020304050mAU050100150200 DAD1 C, Sig=203,16 Ref=360,100 (H:1DATAHUPINGGSSIDE14.D)min1020304050mAU05101520253035 DAD1 C, Sig=203,16 Ref=360,100 (H:1DATAHUPINGGSSIDE15.D)min1020304050mAU020406080100 DAD1 C, Sig=203,16 Ref=360,100 (H:1DATA

5、HUPINGGSSIDE16.D)R1Rg1ReRb1RdABCRg1Rg1ReReRfRb1RcRb2RdRc三种药材的三种药材的HPLC指纹图谱指纹图谱9 高效液相色谱仪的结构示意，一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。 其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 10l 液相色谱中采用梯度洗脱，目的：缩

6、短分离时间；提高分离效果。 l 梯度洗脱：让流动相的组成随时间而改变，以调节流动相的极性、离子强度或pH，使样品组分的相对保留值得以改变，从而提高分离效率。l 梯度洗提与气相色谱中的程序升温类似，但是前者连续改变的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度 l 梯度洗脱中为保证流速的稳定，必须使用恒流泵，否则难获重复结果。l优点：优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。 缺点：缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。11溶剂溶剂A溶剂B电磁阀A电磁阀B混合室泵溶剂A溶剂B高压泵A 高压泵B混合室低压溶剂梯度方框图高压溶剂梯度方框

7、图n 梯度洗提流程121314流 程15 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压

8、泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。l 在液相色谱中, 为什么对所用的流动相进行脱气处理?答 防止在检测器流动池内释出气泡产生干扰信号, 溶解在流动相中的氧有可能与固定相或试样发生反应。17进样阀进样阀181920 色谱柱色谱柱是液相色谱的是液相色谱的心脏部件心脏部件，它包括，它包括柱管柱管与与固定相固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5 530cm3

9、0cm，内径为内径为4 45mm5mm，凝胶色谱柱内径，凝胶色谱柱内径3 312mm12mm，制备往，制备往内径较大，可达内径较大，可达25mm 25mm 以上。以上。一般在分离前备有一一般在分离前备有一个个前置柱前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。证分离技的性能不受影响。21 柱体为直型不锈钢管，见下图柱体为直型不锈钢管，见下图 柱子装填得好坏对柱效影响

10、很大柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度。对于细粒度的填料（的填料（20m）一般采用）一般采用匀浆填充法匀浆填充法装柱，先将装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。22 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。 一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:2

11、31）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高3）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低,温度要求严格。 几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此示差折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7gcm-3。主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 4）电化学检测器 5）化学发光 24紫外可见光、电化学检测器的流通池比较25 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点特点：选择性检测器，如芳烃类化合物的检测；灵敏度高，选择性检测器，如芳烃类化合物的检测；灵敏度高，可检测可检测10-9g/mL的物质；线性范围