兔血清醋酸纤维薄膜电泳实验

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1、实验目的1.学习如何设计实验，训练学生独立设计并完成实验的能力。2.通过从血清中分离、纯化、鉴定血清白蛋白的实验，培养学生综合应用盐析、离心、色谱、电泳分光等技术来分离纯化特定蛋白质的技能，从牛血清中分离提取白蛋白，并鉴定。 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质, 约占总量的60%，牛血清白蛋白分子量约66.2kDa。它是一种水溶性很强的蛋白, 结构稳定, 能结合多种小分子, 如脂肪酸, 胆红素, 血红素等, 起维持血液的正常渗透压作用. 白蛋白分离纯化的意义从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。工业生产的需要：食品、发酵、纺

2、织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。基因工程的需要分离纯化的要求1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究蛋白和一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。分离纯化的一般程序选择材料选择材料破碎细胞破碎细胞提取提取分离纯化分离纯化

3、分析及鉴定分析及鉴定（盐析，离子交换色谱）（盐析，离子交换色谱）（电泳）（电泳）（离心）（离心）1. 粗提盐析原理: 不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀，逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。 影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。操作: 取0.5ml血清 取0.5ml饱和(NH)SO溶液，缓慢滴入，边加边摇。 混匀后于室温中放置10分钟。 8000r/min10min 小心吸取上清液备用，初步获得白蛋白。 操作操作2. 2. 脱盐 盐析后的粗分离样品中含有硫酸铵离子成分， 样品中含有过高的离子浓度会影响离子交换层析的效果，所以在用离子交换层析进行细分级前需要脱盐。 透析已成为生物化学实验

4、室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。 透析原理：通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。通常是4透析，升高温度可加快透析速度。 操作：新透析袋用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌

5、满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间。在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。放入盛有蒸馏水的大烧杯中，磁子搅拌，于4 透析过夜,按时更换透析液。检查透析效果：1 BaCl2检查(NH4)2SO43. 纯 化 离子交换色谱是蛋白质提纯中得到最广泛应用的方法之一。它是以离子交换剂为固定相，利用蛋白带电部分与具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱的不同，而将混合物中的不同蛋白进行分离的色谱技术。原理：离子交换剂具有带电荷的酸性基团或碱性基团作离子交换基团，通过静电作用与带有相反电荷的离子结合。当流动相中存在其他相反电荷的离子时，就与