实验3 B细胞杂交

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1、 B淋巴细胞杂交淋巴细胞杂交实验三实验三实验目的实验目的v熟悉细胞杂交及单抗制备的基本原理；熟悉细胞杂交及单抗制备的基本原理；v掌握细胞融合的基本操作掌握细胞融合的基本操作杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理 具有分泌功能的具有分泌功能的B细胞难以在体外长期存活。利用细细胞难以在体外长期存活。利用细胞融合技术，将免疫后的胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能长期存活的细胞与在体外能长期存活的骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养获取杂交细胞，骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养获取杂交细胞，这种细胞称为杂交瘤细胞（这种细胞称为杂交瘤细胞（Hybridoma）该细胞的特点：该细胞的特点： 1、具有免疫

2、、具有免疫B淋巴细胞分泌特异性淋巴细胞分泌特异性mAb的能力；的能力； 2、具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力、具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力故应用杂交瘤细胞生产单克隆抗体故应用杂交瘤细胞生产单克隆抗体杂交的目的杂交的目的制备单克隆抗体制备单克隆抗体实验原理实验原理杂交瘤技术基本过程示意图杂交瘤技术基本过程示意图材料与器材材料与器材v1、Balb/C小鼠，小鼠，68周龄，雌性周龄，雌性v2、细胞：对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞、细胞：对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0v3、试剂：、试剂：RPMI1640培养液、优质新生牛血清、培养液、优质新生牛血清、HAT选择性培养基、细胞融合剂（选择性培养基、细胞融合

3、剂（PEG）、佐剂、）、佐剂、可溶性抗原可溶性抗原v4、仪器：温控低速离心机、倒置显微镜、仪器：温控低速离心机、倒置显微镜v6、器材：、器材：10 ml塑料针筒、剪刀与镊子等塑料针筒、剪刀与镊子等v乳化：乳化：将抗原与佐剂混合的过程（将抗原与佐剂混合的过程（1:1）v乳化的方法：乳化的方法： 研磨；研磨； 注射器混合法；注射器混合法； 快速乳化法：利用超声波粉碎器快速乳化法：利用超声波粉碎器v乳化好的标志：乳化好的标志：取一滴乳化剂滴入冷水中呈现球形而不分散。取一滴乳化剂滴入冷水中呈现球形而不分散。如出现平展扩散即为未乳化好。乳化过的物质放置一段时间如出现平展扩散即为未乳化好。乳化过的物质放置

4、一段时间（在保存期内）出现油水分层也是未乳化好的表现（在保存期内）出现油水分层也是未乳化好的表现操作步骤操作步骤实验步骤：抗原乳化实验步骤：抗原乳化v免疫：皮下多点及腹腔注射免疫：皮下多点及腹腔注射操作步骤操作步骤实验步骤：免疫动物实验步骤：免疫动物处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。处死小鼠，固定于解剖架上打开腹腔，取出脾脏。置置于于120目的钢丝网中目的钢丝网中，将网移入盛有，将网移入盛有20ml生理盐水的生理盐水的平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬平皿中，用注射针芯轻轻压磨，使其成为单个细胞悬液，吸取液，吸取1ml细胞悬液（约细胞悬液（约5106细胞）细胞）, 与骨髓

5、瘤与骨髓瘤细胞细胞SP2/0（5105细胞）混合，离心后弃上清细胞）混合，离心后弃上清骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞:免疫脾细胞为免疫脾细胞为1:10一个脾脏可获约一个脾脏可获约108个细胞个细胞实验步骤：免疫脾细胞的制备实验步骤：免疫脾细胞的制备操作步骤操作步骤 1、取、取 PEG（polyethylene glycol，聚乙二醇聚乙二醇）溶液溶液1.0ml 缓慢加入混合细胞中缓慢加入混合细胞中,边加边搅拌；边加边搅拌；2、静止、静止1分钟；分钟；3、加、加HAT培养基培养基4ml；4、取融合细胞悬液、取融合细胞悬液1ml,滴加在滴加在96孔培养板中，孔培养板中，每孔每孔1滴（约滴（约50l）；）；5

6、、显微镜下观察融合细胞的状态、显微镜下观察融合细胞的状态实验步骤：细胞的融合实验步骤：细胞的融合操作步骤操作步骤注意事项注意事项v1、取小鼠脾脏细胞时，要正确抓住小鼠，以免被其咬伤、取小鼠脾脏细胞时，要正确抓住小鼠，以免被其咬伤v2、脾脏细胞和骨髓瘤细胞混合离心后，要彻底弃去上清、脾脏细胞和骨髓瘤细胞混合离心后，要彻底弃去上清v3、融合时要缓慢加入、融合时要缓慢加入PEG融合，并边加边轻轻搅拌，以融合，并边加边轻轻搅拌，以保证细胞与融合剂的充分接触保证细胞与融合剂的充分接触v4、观察融合细胞时，轻拿轻放，以免克隆细胞分散造成、观察融合细胞时，轻拿轻放，以免克隆细胞分散造成判断错误判断错误v5、

7、严格无菌操作、防止污染、严格无菌操作、防止污染v6、防止原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性细胞：大量冻、防止原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性细胞：大量冻存、定期再克隆，定期抗体检测存、定期再克隆，定期抗体检测实验结束后，将实验小鼠放入垃实验结束后，将实验小鼠放入垃圾袋，使用过的剪刀、镊子、试圾袋，使用过的剪刀、镊子、试管、吸管及培养板等冲洗干净，管、吸管及培养板等冲洗干净，放回原处，谢谢合作！放回原处，谢谢合作！ 思考题思考题v细胞融合后有几种状态的细胞存在？细胞融合后有几种状态的细胞存在？ HAT培养基选择培养的原理与目的培养基选择培养的原理与目的是什么是什么？ 动物免疫动物免疫BALB/C or

8、igin, 6-8wk, female mouse Choice of animal1wk 抗原抗原50g/只，溶于只，溶于300l 生理盐水中，加入等量福氏完全生理盐水中，加入等量福氏完全 佐剂（佐剂（CFA）充分）充分乳化乳化，分颈部皮下多点及腹腔注射；，分颈部皮下多点及腹腔注射；3wk 抗原的剂量及注射的部位同上，仅将全佐改为半佐（抗原的剂量及注射的部位同上，仅将全佐改为半佐（IFA）；）；5wk 抗原抗原50g/只，溶于只，溶于300l 生理盐水中，腹腔注射；生理盐水中，腹腔注射；加强加强 融合前融合前35天，抗原天，抗原2030g /只，溶于只，溶于50l 生理盐水中，生理盐水中，

9、小鼠尾静脉注射以加强免疫小鼠尾静脉注射以加强免疫动物免疫动物免疫一、可溶性抗原一、可溶性抗原1wk 细胞数量细胞数量8106/只，洗涤三遍，用只，洗涤三遍，用0.30.4ml的生理的生理 盐水重悬，腹腔注射；盐水重悬，腹腔注射；3wk 细胞数量细胞数量6106/只，细胞的预处理及注射的部位同上；只，细胞的预处理及注射的部位同上；5wk 细胞数量细胞数量5106/只，细胞的预处理及注射的部位同上；只，细胞的预处理及注射的部位同上；加强加强 融合前的融合前的45天，细胞数量天，细胞数量3106 /只，加强免疫只，加强免疫 在以肿瘤细胞作免疫原时，为避免免疫过程中小鼠因生长肿瘤在以肿瘤细胞作免疫原时

10、，为避免免疫过程中小鼠因生长肿瘤而死亡，故用丝裂霉素（而死亡，故用丝裂霉素（MMC）处理免疫原细胞，抑制其生长繁）处理免疫原细胞，抑制其生长繁殖以防形成肿瘤。最后的加强免疫，肿瘤细胞可不经殖以防形成肿瘤。最后的加强免疫，肿瘤细胞可不经MMC处理。处理。 二、细胞抗原二、细胞抗原动物免疫动物免疫 HAT: 次黄嘌呤（次黄嘌呤（hypoxanthine，H） 氨基碟呤（氨基碟呤（aminopterin，A）：叶酸拮抗物）：叶酸拮抗物 胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（thymidine, T）细胞的细胞的DNA生物合成有两条途径：生物合成有两条途径：HAT选择性培养选择性培养TK H、THGPRTHGPRT：次

11、黄嘌呤鸟嘌：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶呤磷酸核糖基转移酶TK：胸腺嘧啶激酶：胸腺嘧啶激酶免疫脾细胞与骨髓瘤细免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后的细胞类型胞融合后的细胞类型v未发生融合骨髓瘤细胞及其同核融合体：未发生融合骨髓瘤细胞及其同核融合体：其其DNA合成的主要途合成的主要途径被径被A阻断后，由于缺乏阻断后，由于缺乏HGPRT而不能利用培养液中的而不能利用培养液中的H，虽，虽TK可利用可利用T，但不能完成完整的，但不能完成完整的DNA合成过程；合成过程；v未发生融合的脾细胞及其同核融合体：未发生融合的脾细胞及其同核融合体：培养液中不能长期生长，培养液中不能长期生长，7天左右即死亡天左右即死亡v

12、脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：脾细胞和骨髓瘤细胞的异核融合体：即即杂交瘤细胞，既从脾细杂交瘤细胞，既从脾细胞获得了胞获得了HGPRT和和TK，从而利用培养液中的，从而利用培养液中的H和和T合成合成DNA，又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力又从骨髓瘤细胞获得了无限增殖的能力，因此能在，因此能在HAT选择培选择培养液中生存下来。养液中生存下来。 细胞融合剂细胞融合剂1、现在一般杂交瘤融合使用聚乙二醇、现在一般杂交瘤融合使用聚乙二醇 polyethylene glycol (PEG)2、PEG的分子量可以多种选择，大部分情况可以使用的分子量可以多种选择，大部分情况可以使用 500-6000分子量的分子量的PEG3、PEG浓度：浓度：30% -50%，低于，低于30%将影响细胞融合将影响细胞融合 率；但若率；但若50%，该物质对细胞会产生明显的毒性，该物质对细胞会产生明显的毒性