淋巴细胞分离与E玫瑰花环形成实验

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1、淋巴细胞分离实验淋巴细胞分离实验E E玫瑰花环形成实验玫瑰花环形成实验实验目的 熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离原理和方法 学习E花环试验的操作方法 观察显微镜下E花环的形态实验原理 淋巴细胞便于在体外对机体免疫细胞进行鉴定、计数或功能测定；还可以用于E花环试验、淋巴细胞转化试验及淋巴细胞培养（需无菌操作）。 淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低。无论采用哪种方法，应最大可能保持细胞应有活性。实验原理 人外周血单个核细胞（PBMC） 包括淋巴细胞和单核细胞。 单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于1.075-1.090

2、之间的聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布,从而分离出PBMC。人血液中各种细胞的密度如下：红细胞：1.093白细胞：1.092淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090血小板：1.030-1.035F/H= 1.0770.001肝素抗凝全血+等量Hanks液将将F/H管稍倾斜管稍倾斜将稀释血液在距分层液界面上将稀释血液在距分层液界面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分层液上处沿试管壁缓慢加至分层液上面。面。应注意保持两界面清晰，勿使血应注意保持两界面清晰，勿使血液混入分层液内。液混入分层液内。Ficoll/Hypaque

3、(2:1)1500rpm, 20 min 水平离心血小板血小板用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中。将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液或RPMI-l640洗涤2次，1500 rpm 5min。实验原理 本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差异（外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.0740.001），利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。实验原理 人 T淋巴细胞表面的CD2分子即绵羊红