抗原决定簇选择
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1、.抗原决定簇的确抗原决定簇的确立与选择（一）立与选择（一）.报告内容 概念概念 .抗原表位抗原表位-定义定义v抗原表位，又称抗原决定簇抗原表位，又称抗原决定簇(antigenic determinant，AD)，是指，是指抗原分子中抗原分子中决定抗原特异性决定抗原特异性的特殊化学基团，因而表位代表的特殊化学基团，因而表位代表了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫细了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫细胞表面的抗原受体结合。严格说来，抗体的特异性是针对表胞表面的抗原受体结合。严格说来，抗体的特异性是针对表位而不是针对完整的抗原分子的。位而不是针对完整的抗原分子的。v抗原
2、通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的抗原受体抗原受体结合，结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应从而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应抗抗体或致敏淋巴细胞体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应。发生特异性结合而发挥免疫效应。v抗原表位的抗原表位的性质、数目和空间构型性质、数目和空间构型决定抗原的特异性。决定抗原的特异性。. 抗原分子以其B细胞表位与抗体分子的抗原结合部位发生互补性结合A.抗原-抗体复合物的立体构象；B.采用电脑技术将抗原和抗体分子分开，可见抗原和抗体分子的相互作用仅发生在抗原分子的B细胞表位和抗体分子的抗原
3、结合部位之间，两者呈现结构互补。C.抗体的互补决定区与抗原表位结合示意图 C.v一般情况下，一个多肽表位含56个氨基酸残基；一个多糖表位含57个单糖；一个核酸半抗原的表位含68个核苷酸。v抗原表位的大小与相应抗体的抗原结合部位相适合。v一个抗原表位的特异性由组成它的所有残基共同决定，但其中有些残基在与抗体结合时比其它残基起更大作用，这些残基被称为免疫显性基团免疫显性基团。 .抗原表位-分类v覆盖型和非覆盖型表位覆盖型和非覆盖型表位 某些抗原分子表面，不同表位之间相对分离，各自结合特异性抗体，互不影响，这类表位被称为非覆盖型表位非覆盖型表位。 若某一表位与相应抗体结合会影响另一表位与抗体的结合，
4、此类表位称为覆盖型表位覆盖型表位。 v功能性和隐蔽表位功能性和隐蔽表位 位于抗原分子表面的表位易被相应淋巴细胞所识别，即具有易接近性，可直接启动免疫应答，故称为功能性表位功能性表位。 存在于抗原分子内部的表位无直接触发免疫应答的功能，称为隐蔽表位隐蔽表位。若通过理化因素处理抗原，使其结构发生改变，内部的隐蔽表位被暴露，可能成为新的有功能的表位。 .v按表位结构不同，分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位。 连续性表位又称线性表位，是由肽链上顺序连续的氨基酸组成通常这种结合比较弱，因为小肽并不含完整天然蛋白的构象，在多数情况下这种表位可能只代表了复杂表位的一部分。对其研究依赖于多肽固相化学合成技术
5、。 后者又称构象型抗原表位，是由那些空间邻近但顺序上不连续的氨基酸组成。分类. 按照与抗原受体细胞结合不同，分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。分类特性特性T细胞表位细胞表位B细胞表位细胞表位表位分子TCRBCRMHC分子分子必需必需无需表位性质主要是线性多肽天然的多肽、多糖、脂多糖、有机化合物表位大小8-12氨基酸(CD8-TC)12-17氨基酸(CD4-TC)5-15个氨基酸，5-7个单糖或5-7个核苷酸表位类型线性表位构象、线性表位表位位置抗原分子任意部位抗原分子表面.研究意义v表位是蛋白质抗原性的基础 ，研究蛋白质抗原表位， 对于设计具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型诊断
6、试剂具有较大意义。v应用：多在诊断与疫苗的研究中,尤其是在制作良好的特异性诊断试剂盒中更为重要。.抗原表位研究方法v 通过化学或生物学方法处理抗原分子以获得多肽碎片，再利用单克隆抗体筛选能与之起阳性反应的片段。u1.1 用化学法或酶“切割”抗原，分离抗原肽段v该法对蛋白质的一级结构不作要求，但测定结果只能是抗原的线性表位。v化学切割法中常用的试剂：CNBr，NTCB，IBA，甲醇。v酶法切割常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶和V8 蛋白酶等。v水解后采用各种分离方法如SDS-PAGE、凝胶过滤、离子交换将水解片段分开，然后用Western blot，ELISA等各种检测手段来检测。结果可通过理论肽段
7、分子量的推断或相应的氨基酸序列分析来判断。v利用该法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌细胞增强蛋白、乙酰胆碱酯酶、玻璃体结合蛋白、磷脂酶基质蛋白等。1.传统化学“切割”法或酶法（classical epitope mapping）.研究方法u1.2 水解抗原-抗体复合物 v这是一个直接的确定线性及构象性抗原表位的方法，又称为Protein footprinting。其理论依据为抗原-抗体复合物的结合部位能抵抗蛋白酶的水解。根据蛋白质抗原性质的不同常采用3种方法。 对于蛋白酶水解位点较少的抗原，一般先将抗原与等摩尔抗体在PBS中反应，然后酶解，SDS-PAGE分离水解产物，分析结果。 对于蛋白酶水解位
8、点较多的抗原，采用HPLC法，将抗原-抗体复合物的酶解片段和同样条件下的抗原酶解片段分别用HPLC分析。两者图谱对应峰峰高比大于平均数值的片段则推测为抗原表位。 对于能确定为线性表位的抗原可先将抗体连接于固相载体上，并将此固相载体装柱，然后让过量的抗原溶液通过此柱，使抗原-抗体形成复合物。一定条件下，酶溶液过柱，酶解此抗原-抗体复合物，PBS洗去酶解下的不结合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下与抗体结合的肽段。HPLC分析这些片段以确定结果。v近来，质谱技术在这类结果分析中得到了广泛的应用。采用该法已成功地确定了细胞色素C，胃泌素释放肽(GRP)，脂碱性磷酸酶(PLAP)等的抗原表位。.2.
9、 合成肽库方法v有机合成法就是直接利用固相肽合成技术，合成含有各种可能序列的短肽。通过这种合成可以保证各种序列的多肽等机率出现，每个载体上只含有一种序列的短肽。v优点是构建方法简单，迅速。缺点是不能扩增，筛选比较麻烦，需进行荧光标记或ELISA，在显微镜下操作工作量比较大。v在研究构象性表位时的minotopes方法即采用类似的方法，通常从二肽开始合成并逐渐增加肽链长度及置换氨基酸种类，直至达到与抗体的最大结合为止。研究方法u 2.1 有机合成法肽库是大量某一长度(如六肽)的短肽的集合，它包括了该长度的短肽的各种可能序列或其中的绝大部分。.该法先利用基因克隆技术将合成的一组寡核苷酸混合物（小肽
