引物设计和实时荧光定量pcr
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1、温州医科大学附属第二医院科研中心温州医科大学附属第二医院科研中心葛仁山葛仁山 2014.8.4目录目录一、荧光定量PCR技术的基础理论二、引物的设计及原则三、内参基因的选择四、定量PCR的实验设计和数据处理五、实时定量PCR两种相对定量方法比较六、误差分析及操作规范七、实验中污染的防控八、实验结果的分析一、荧光定量PCR技术的基础理论1 1、荧光定量、荧光定量PCRPCR技术概论技术概论 荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代，由于该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广
2、泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。1 1、荧光定量、荧光定量PCRPCR技术概论技术概论 荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。 系统组成：定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。 常规常规PCRvsPCRvs实时实时PCRPCR 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析 定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析常规常规PCRvsPCRvs实时实时PCRPCR
3、优缺点比较 定量PCR 常规PCR灵敏度高高精确度安全省时只能进行半定量或定性分析不安全易污染费时费力2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念 扩增曲线、阈值、CT值（1）、扩增曲线及扩增曲线的两种形式 左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念（2）、阈值线 在荧
4、光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。2 2、荧光定量、荧光定量PCRPCR常用的三个概念常用的三个概念（3）、CT值 PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数。3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础 荧光定量PCR是随着PCR循环的进行，以荧光信号强度的积累来实时反映PCR反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特点： （1）、本底低（2）、荧光强度高（3）、每轮PCR反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧 光强度的增高和每轮循环后PCR产物的量成线性关系（4）、没有PCR产物时，
5、没有荧光（5）、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种 荧光不会产生荧光的交叉干扰3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础目前常用的几种荧光物质（1）、Taqman探针类5端标记荧光基团，3端标记淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光；探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针与目的基因互补序列结合，随着PCR反应的进行，在Taq酶5-3外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础Taqman常用的荧光基团和淬灭基团 荧光基团：5端常用荧光基团FAM标记，最佳激发光
6、波长：494-495nm，最大 发射光波长：518-520nm。淬灭基团：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。 TAMRA本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，500 560nm，最佳激发光波长在560nm附近，对FAM基团产生的发射光 具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，560650nm，当做 多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已 不常用。 BHQ和ECLIPSE为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会 产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较 为常用，尤其在多重荧光定量PCR时常常被采用。3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础T
7、aqman探针的特点及应用（1）、特异性强、准确性高 本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异 性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与PCR产物 的量成正比关系，因此准确性极高。（2）、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使 用，普通的Taq酶就能满足实验的要求。（3）、常被用作基因含量的精确检测(精确度可达几十个拷贝) 及基因表达变化的精确分析（精确度可达0.1倍的变 化）。（4）、目前价格也不是太贵，2OD 1000.00左右3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础（2）、荧光染料类 目前常用的荧光染料为SYBR Green、SYBR Green、 SYTO
8、9、HRM等。其共同性质为： （a）、结合于双链核酸的小沟处 （b）、与双链DNA结合后受激产生荧光 （c）、在变性条件下双链分开，荧光消失3 3、荧光定量、荧光定量PCRPCR的化学基础的化学基础荧光染料的特点及应用（1）、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与 双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；（2）、可做双链核酸的熔解曲线分析；（3）、SYBR Green染料本身价格便宜，但是做荧光定量PCR时对引物设 计的要求很高；对Taq酶要求较高，最好是HotStar Taq酶，或者操 作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩 增会严重干扰结果的准确性，
9、尤其是模板含量较低时；（4）、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；（5）、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。（6）、对PCR反应的毒性，能抑制PCR反应，降低PCR反应的效率。两种化学试剂的比较两种化学试剂的比较化学试剂化学试剂工作原理工作原理有否淬灭剂有否淬灭剂信号检测阶段信号检测阶段SYBR Green ISYBR Green I结合于双链结合于双链DNADNA的小沟中的小沟中否否延伸延伸TaqManTaqMan水解型杂交探针水解型杂交探针（5-35-3外切）外切）有有任何步骤任何步骤4 4、荧光定量、荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理 对于普通的PCR反应
10、来说 n Xn=X0（1E）上式中， Xn为n轮PCR循环后，目的基因PCR产物的量；n为PCR循环数；X0 为目的基因的初始模板量，E为PCR的反应效率，0E1。4 4、荧光定量、荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理 由于PCR反应体系中荧光物质的荧光强度与PCR产物的量成正比，所以用荧光强度来代替PCR产物的量，我们可以得到： Rn= RB+ X0(1+ E) Rsn总荧光信号强度=本底信号+分子数量单位信号强度Rn：第n个循环时的总信号RB：本底RS：单位信号强度X0：起始DNA数目E： PCR效率4 4、荧光定量、荧光定量PCRPCR的数学原理的数学原理 当循环数n等于CT值时，所
11、有样品荧光信号强度变化量的对数全部一致，都达到了阈值。 RT= RB+ X0(1+ E) Rs lg(RT -RB) = lgX0 + CT lg(1+ E) + lg Rs CT lg(1+ E) = -lgX0 + lg(RT -RB) lg Rs 此时，PCR反应处于指数期阶段，所有样品的反应效率E稳定且近似相等； lg(RT -RB)、Rs也都相同，只有CT值和-lgX0为变量，且这两个变量之间成一次性方程。 也就是说， 所有样品的lgX0与到达阈值时的循环数n（Ct值）呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量CT5 5、荧光定量、荧光定量PCRPC
