海洋生物药理活性化合物分离纯化研究实例

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1、Stelletta grubiiSchmidt 星芒海绵素星芒海绵素A抗肿瘤活性抗肿瘤活性异马拉巴烷型三萜异马拉巴烷型三萜新鲜样品50kg淡水洗涤（除盐）切成小块50L塑料桶，95乙醇浸泡提取4 weeks 3 times减压浓缩流浸膏10L二氯甲烷萃取萃取物2kg悬浮于90甲醇水溶液石油醚萃取水相萃余物90甲醇水相萃余物石油醚萃取物1.5kg80甲醇水溶液加水稀释CCl4萃取萃取物250g200300目硅胶柱层析二氯甲烷甲醇梯度洗脱Frac1 Frac2 Frac3 Frac4 Frac5Frac10硅胶柱层析（石油醚乙酸乙酯3：1洗脱 石油醚丙酮1：1洗脱）RP-HPLC制备分离（65甲醇

2、洗脱, 3mL/min）化合物1化合物2 化合物3 化合物4目标为低极性成分目标为低极性成分2.鲨肝醇鲨肝醇3.尿嘧啶尿嘧啶4.胸腺嘧啶脱氧核苷胸腺嘧啶脱氧核苷化合物化合物1星芒海绵素星芒海绵素A黄色针晶黄色针晶异马拉巴烷型三萜异马拉巴烷型三萜n草苔虫又名苔藓虫、草苔虫又名苔藓虫、海席子、假珊瑚及群海席子、假珊瑚及群虫等，属草苔虫科虫等，属草苔虫科bugulidae真体腔动真体腔动物，是海洋底栖动物物，是海洋底栖动物中的重要一种。中的重要一种。n总合草苔虫总合草苔虫 Bugula neritina (Linnaeus)n采集地：南海的采集地：南海的3个个不同海域不同海域新鲜样品12吨风干样品2

3、00kg95乙醇500L加热提取2 hour 3 times减压浓缩混悬水溶液20L乙酸乙酯萃取（1：1，5次） 萃取物1.2kg（抗肿瘤活性有效部位）水相萃余物粗总合草苔虫总酯组分进一步精制的总酯组分硅胶柱层析石油醚丙酮5:11:1梯度洗脱多次SephadexLH-20层析：二氯甲烷：甲醇1:1；正己烷：二氯：甲醇4:5:1；正己烷：二氯：甲醇10:10:1及其他系统200300目硅胶柱层析二氯甲烷甲醇梯度洗脱TLC检测bryostatinRP-HPLC制备分离85甲醇洗脱, 2mL/min228nm检测活性跟踪分离进一步精制的总酯组分ODS反相硅胶柱层析50100甲醇梯度洗脱活性成分2.5

4、g45681011161819一系列草苔虫内酯类化合物n总草苔虫内酯体外抗癌活性总草苔虫内酯体外抗癌活性n活性筛选结果表明，总草苔虫内酯对活性筛选结果表明，总草苔虫内酯对K562人红白细胞白血病细胞株具有超强的抑制人红白细胞白血病细胞株具有超强的抑制作用，作用， 110-18 m mg/ml；对；对U937人单核细胞白血病细胞株也有较强的抑制人单核细胞白血病细胞株也有较强的抑制活性，活性， 平均为平均为1.7m mg/ml.nBryostatin 19体外抗癌活性结果体外抗癌活性结果nbryostatin 19对U937人单核细胞白血病细胞株具有极强的杀灭作用极强的杀灭作用(2.810-3mg

5、/m1)，同时对HL-60人早幼粒细胞白血病和K562人红白细胞白血病等细胞株均有显著的抑制作用。n柔荑软珊瑚柔荑软珊瑚Nephthea spn软珊瑚亚目，软珊瑚亚目，Nephtheidae科，多触手科，多触手n采自中国南海西沙群岛采自中国南海西沙群岛永兴岛永兴岛n由中国南海海洋研究所由中国南海海洋研究所邹仁林研究员鉴定邹仁林研究员鉴定新鲜样品6kg95乙醇室温浸泡提取10 day 5 times减压浓缩褐色膏状物74.3g65乙酸乙酯洗脱组分A多次柱层析重结晶100200目硅胶快速柱层析石油醚乙酸乙酯梯度洗脱水洗，剪碎75乙酸乙酯洗脱组分B多次重结晶甾醇1甾醇2nMTT法体外抗肿瘤活性法体外

6、抗肿瘤活性实验表明：实验表明：n两种甾醇化合物对肝癌细胞两种甾醇化合物对肝癌细胞(BEL-7402)、小鼠白血瘤细胞小鼠白血瘤细胞(P388)、人结肠癌细胞、人结肠癌细胞(LOVO)和人乳腺癌细胞和人乳腺癌细胞(MCF)表现出抑制表现出抑制活性。活性。n海藻是海洋生物中的一大类群，相关化学和活性海藻是海洋生物中的一大类群，相关化学和活性成分的研究主要集中在红藻和褐藻；尽管绿藻代成分的研究主要集中在红藻和褐藻；尽管绿藻代谢产物也具有较好的生物活性，但是可能由于其谢产物也具有较好的生物活性，但是可能由于其种群相对较少同时含有大量种群相对较少同时含有大量色素色素，因此相关报道，因此相关报道很少。很少

7、。n为了寻找具有特殊结构的化合物供活性筛选，笔为了寻找具有特殊结构的化合物供活性筛选，笔者首次对广泛分布于我国南海海域的绿藻基根硬者首次对广泛分布于我国南海海域的绿藻基根硬毛藻毛藻Chaetomorpha basiretorsa Setchell进进行了比较系统的研究行了比较系统的研究n基根硬毛藻Cbasiretorsa Setchell采自广东省湛江市硇洲岛，由中国科学院海洋研究所夏邦美研究员鉴定。新鲜样品100200kg风干样品14.3 kg95乙醇浸泡提取减压浓缩膏状物574 g乙酸乙酯萃取 萃取物370 g水相萃余物Sephadex LH-20柱层析石油醚:氯仿:甲醇5:5:1洗脱硅胶

8、柱层析石油醚乙酸乙酯梯度洗脱TLC检测化合物I35mgII35mgIII528mgIV12mg粉碎一般每次35天，3次以上蒸馏水悬浮可先用石油醚萃取除叶绿素组分A1 A2A3A4A5A6A75:1色素主组分Sephadex LH-20柱层析，石油醚:氯仿:甲醇5:5:1洗脱色素主组分反复硅胶柱层析石油醚:丙酮8:1HPLC纯化75甲醇反复硅胶柱层析石油醚:丙酮20:1化合物V26mgVI18mgn4个无环二萜：n7，11，15-trimethyl-3-methylene-hexadecan-1，2-diol (I)n3，7，11，15-tetramethyl-hexadecan-1，3-dio

9、l ()n2个长链脂肪族化合物：nPhytol (III)nPhytenal (IV)n甘油-1-软脂酸酯 (V)n十六烷-3-烯酸 (VI)n药理活性：药理活性：n用用MTT法对上述化合物在人肿瘤细胞法对上述化合物在人肿瘤细胞KB、Bel-7402、PC-3M、KeTr3和和MCF-7上进行了细胞毒活性测试，结上进行了细胞毒活性测试，结果表明，化合物果表明，化合物I对人肿瘤细胞对人肿瘤细胞KB、KeTr3和和MCF-7人肿人肿瘤细胞株显示一定的选择性毒性，瘤细胞株显示一定的选择性毒性，IC50分别为分别为3.42、2.38、1.78m mgmL。n另外，用另外，用MTT法对上述化合物在犬血管

10、平滑肌细胞模型上法对上述化合物在犬血管平滑肌细胞模型上进行增殖抑制活性测试，以胰岛素为阳性对照，并对结果进行增殖抑制活性测试，以胰岛素为阳性对照，并对结果进行组间进行组间t检验，结果表明，在检验，结果表明，在0125 mgmL质量浓质量浓度下，同阳性对照组吸光度值相比较，化合物度下，同阳性对照组吸光度值相比较，化合物I、III和和的吸光度值呈现统计学显著性差异的吸光度值呈现统计学显著性差异(P005)，表明以，表明以上化合物具有一定的抑制犬血管平滑肌细胞增殖活性。上化合物具有一定的抑制犬血管平滑肌细胞增殖活性。菌株A01059250mL三角瓶100mL种子培养基葡萄糖10g大豆粉10g酵母膏1

11、0g可溶性淀粉5gKH2PO4 0.5g天然陈海水1000mLpH 7.228C 150rpm48h种子发酵培养基大豆粉10g玉米粉10g可溶性淀粉5gKH2PO4 0.5g天然陈海水1000mLpH 7.26%接种量28C 150rpm6 days发酵液8000rpm离心10min菌丝体上清液乙酸乙酯萃取萃余水相萃取液减压浓缩活性提取物HPLC分析HPLC半制备 活性追踪活性色谱峰分析条件为：流动相为甲醇-水，甲醇由30在20 min内线性升到60，然后再20 min线性升到100，流速1 ml/min，检测波长220 nm。根据分析条件确定Waters Delta Prep4000半制备液

12、相色谱仪对各组分进行制备的流动相条件为：waters NovaPak C18 (25 mmx200 mm,6 mm)；流动相为甲醇-水，甲醇由35保持15 min后，15 min内线性升到90，然后再保持10 min，流速15ml/min，检测波长220nm，室温。活性物质活性物质(结构待定结构待定)n活性检测活性检测n采用纸片扩散法，将稻瘟病菌的孢子悬液均匀涂采用纸片扩散法，将稻瘟病菌的孢子悬液均匀涂布于土豆汁固体培养基上，取直径为布于土豆汁固体培养基上，取直径为6 mm无菌无菌滤纸片轻贴于检测平板上，滴加滤纸片轻贴于检测平板上，滴加10m mL待测样品待测样品/纸片，纸片，28下培养下培养24 h后，测量抑菌圈直径。每后，测量抑菌圈直径。每个样重复个样重复3次取平均值。次取平均值。