PCR技术详解课件
《PCR技术详解课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR技术详解课件（35页珍藏版）》请在文档大全上搜索。
1、1 PCRPCR技术详解技术详解2一一二二三三四四五PCRPCR简史简史定义定义基本原理基本原理反应要素反应要素PCRPCR的类型的类型六六PCRPCR反应流程反应流程目录八常见常见问题分析问题分析九PCRPCR技术应用领域技术应用领域七PCRPCR产物检测产物检测3一、一、PCRPCR简史简史 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了4 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人
2、发明了聚合酶链反应（PCR） 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错，未能推广 1988年，Saiki等人从嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提出TaqDNA聚合酶，使得PCR技术得以广泛应用 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖5二、定义二、定义 PCR(PCR(聚合酶链式反应）是利用聚合酶链式反应）是利用DNADNA在体外高在体外高温（温（9595左右）时左右）时变性变性成单链，低温成单链，低温退火退火（经常是（经常是6060左右）时引物与单链按碱基互补配对原则结合，左右）时引物与单链按碱基互补配对原则结合，
3、再调温度至再调温度至DNADNA聚合酶最适反应温度（聚合酶最适反应温度（7272左左右），右），DNADNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖聚合酶沿着磷酸到五碳糖(53)(53)的的方向方向延伸延伸合成互补链合成互补链6三、基本原理三、基本原理 PCR技术模拟DNA 的天然复制过程, 其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物, 该原理主要包括3个基本反应过程：模板变性引物退火新链延伸71234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍http:/ n
4、：循环次数实际拷贝数=(1+x)n X：平均效率,约为0.85 n：循环次数 11四、反应要素四、反应要素1.1.热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶2.2.引物引物3.3.模板模板4.4.dNTPdNTP5.5.二价阳离子二价阳离子6.6.维持维持pHpH的缓冲液的缓冲液121.1. 热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶目前有两种Taq DNA 聚合酶供应：天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠杆菌合成一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100l时）；浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。132. 2. 引物引物引物是PCR特异性反应的关键, PCR
5、产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度；引物浓度引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右；引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb；引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；引物设计原则：14避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；引物3端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败； 引物的熔解温度（Tm值），指把DNA的双螺旋
6、结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。DNA中GC含量越高，Tm值越高，引物对之间的Tm值相差不超过23，经验公式Tm=2(A+T)+4(G+C)，引物的退火温度通常低于Tm值510；引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；引物量：每条引物的浓度0.1 0.5M，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会153. 3. 模板模板模板即DNA片段, 其量的多少及其纯度的高低, 是PCR成败与否的关键环节之一u单、双链DNA均可u不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类u对于哺乳动物
7、基因组DNA开说，每个反应需要的模板量是1g，对于酵母染色体、细菌染色体和质粒等模板的通常用量分别是10ng、1ng、1pg164. dNTP4. dNTPudNTP在温度较高时容易失活, 因此需要-20下冰冻保存,以保证dNTP的质量。u在PCR反应中, dNTP浓度应为200 250mol/L, 尤其重要的是4种dNTP的体积浓度要相等, 否则就会引起错配u过低浓度降低PCR产量，过高浓度的dNTP(大于4mmol)可能会淬灭Mg2+，从而抑制PCR反应175. 5. 二价阳离子二价阳离子l 通常为Mg2+，Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，当dNTP浓度为200mol时， Mg2+浓度在1
