临检培训基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用临检培训班
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1、临检培训基因扩增技临检培训基因扩增技术在遗传病基因诊断术在遗传病基因诊断中的应用临检培训班中的应用临检培训班第二页，共84页。中心法则中心法则 复 转录转录 翻译翻译 DNADNA RNARNA 蛋白质蛋白质 蛋白蛋白 制制 反转录反转录 糖蛋白糖蛋白 脂蛋白脂蛋白 酶类酶类 激素激素 细胞因子细胞因子 第三页，共84页。基因重组技术基因重组技术 基因探针技术基因探针技术 基因重组药物 基因诊断 基因治疗 PKUPKU 尿毒症（口服尿毒症（口服artificial cells)artificial cells)第四页，共84页。基因诊断基因诊断 运用基因探针， PCR技术等探测特定靶基因的存在
2、与否，或是否有基因突变等缺陷，从而对疾病或病原体感染作出诊断叫基因诊断。 基因型 表 型 基 临 血 生 细 影 病 因 床 清 化 菌 像 理 诊 学 学 学 学 学 断 诊 诊 诊 诊 诊 诊 断 断 断 断 断 断第五页，共84页。基因诊断的特点基因诊断的特点灵敏度高（早期）灵敏度高（早期）特异性强特异性强操作简便操作简便取材大多不受组织器官限制取材大多不受组织器官限制可进行早期诊断，症状前诊断及产前诊断可进行早期诊断，症状前诊断及产前诊断检测细菌内病毒等微生物时不需培养检测细菌内病毒等微生物时不需培养第六页，共84页。聚合酶链反应聚合酶链反应Polymerase Chain React
3、ionPolymerase Chain Reaction（PCRPCR） Kary B. Mullis1984 年问世, 成为分子生物学和生命科学发展史上的里程碑1993 荣获诺贝尔奖 Mendocin 128号公路附近一棵七叶树下的突发奇想专利官司之战: DuPont 与Cetus对薄公堂第七页，共84页。 PCR PCR 原理示意图原理示意图第八页，共84页。PCRPCR技术的应用技术的应用一、在分子生物学研究中的应用、在分子生物学研究中的应用二、遗传病的基因诊断和产前基因诊断：二、遗传病的基因诊断和产前基因诊断： 血友病、血友病、 地中海贫血、地中海贫血、DMD、PKU等等等等三、细菌、
4、支原体、衣原体、立克次体等三、细菌、支原体、衣原体、立克次体等四、病毒四、病毒五、白血病、肿瘤五、白血病、肿瘤六、骨髓移植、器官移植供体配型选择六、骨髓移植、器官移植供体配型选择七、法医学七、法医学八、动植物学八、动植物学九、古人类学、古生物学九、古人类学、古生物学 第九页，共84页。第十页，共84页。第十一页，共84页。 PCR原理示意图第十二页，共84页。热变性：从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94下热变性4分钟，使之解为单链。 第十三页，共84页。退火：然后置反应混合物于5
5、5，使引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。并迅速加入2单位耐热的Taq DNA聚合酶，混匀、离心10秒钟。为防止在整个PCR过程中，水份的蒸发影响PCR效果，通常加入35ul石蜡油封盖液面。 第十四页，共84页。引物延伸：置上述反应混合物于70水浴中1-2分钟，在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3端A开始, 沿着53的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。结果，DNA拷贝数增加了一倍。 第十五页，共84页。接着，将上述热变性退火引物延伸（称为一个循环）反复进行30-35次。只是热变性的时间缩短为1分钟左右。每经过一个循环，DNA拷贝数便增加一
6、倍（2）。因此，如进行n次循环，则拷贝数将增加2n倍！进行25个循环，则拷贝数将增加225倍，即上百万倍。在琼脂糖凝胶电泳上可看到特异性长度的扩增带。可见PCR之所以高速扩增的关键是因为每次新合成的DNA链在后来的循环中都可以作模板，犹如滚雪球，数量迅速增加。 第十六页，共84页。如果引物5端有几个与模板DNA不配对的碱基，仍可能与模板DNA退火、延伸，对PCR效果影响不大。这一特点，可使PCR产物两端带上限制酶的Linker，或造成DNA顺序的缺失、插入、碱基替代等。大大增大了PCR技术的应用范围。 第十七页，共84页。影响PCR效果的重要因素及注意事项：PCR技术的原理似乎非常简单明了，P
7、CR反应的操作也并不复杂；但要取得好的结果和良好的可重复性并非易事。必须彻底弄通其分子生物学的奥妙之处，并把握其各种影响因素，规范操作。以下列出影响PCR扩增效果的主要因素 第十八页，共84页。引物设计一定要科学合理，序列的特异性要高。长度一般在18-25个碱基，Tm值可按公式（G+C总数x4）+（A+T总数x2）（）估算。尽可能避开4个以上G或C等相同碱基串联重复。尽可能避免引物内部形成发夹结构或引物之间形成二聚体（Dimer）的可能性。G、C与A、T的比例尽可能1:1左右。同一反应管中的引物（甚至同一个Lab的所有引物）Tm值设计的相同。 第十九页，共84页。引物在反应体系中的浓度要经过优
8、化。双重PCR及多重PCR对各引物浓度间的比例要求更严。 基因组DNA制备液纯度要好。其用量也并非越多越好。 各种试剂小量分装保存，避免多次冻融。dNTP浓度要优化。 第二十页，共84页。退火温度参考Tm值进行优化。其对PCR的成败，非特异产物的出现与否关系最大。Taq DNA聚合酶的厂牌、批号和用量均要合适。对扩增难度较大的PCR，Mg2+浓度要适当增加。操作者的手法也有影响，要在实践中总结提高技术。 第二十一页，共84页。荧光定量PCR行HLA-DrB1位点分型法的建立及与血清学方法的比较第二十二页，共84页。HLA分型技术HLA（人类白细胞抗原）MHC区基因（主要组织相容性复合物基因区）
9、 高度多态性的基因区第二十三页，共84页。HLA分型技术一、淋巴细胞微量细胞毒试验一、淋巴细胞微量细胞毒试验 1964年，年，Paul Terasaki, LA, USA二、二、DNA分型法分型法 优点：优点： 1. 血样不要求新鲜血样不要求新鲜; 2. 白血病患者白血病患者WBC表面抗原被破坏表面抗原被破坏, 只只 能用能用DNA分型法分型法; 3. 结果更准确可靠结果更准确可靠第二十四页，共84页。HLA分型技术nDNA-RPLP, 1982nPCR/SSOnPCR/反向斑点杂交nPCR/SSCPnPCR/SSPnPCR/SBTnR-Q-PCR/SSPnPCR/dHPLC等第二十五页，共8
10、4页。 在序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）技术基础上，将荧光定量PCR（FQ-PCR）技术与SSP结合起来，建立了自动化程度更高的荧光定量PCR- HLA分型技术，完成了46例尸肾供受者的HLA-DBR1分型。 FQ-PCR不需走电泳，减少了污染的机会，提高了自动化程度。同时又开展了以DNA测序为基础的HLA分型（SBT）技术。第二十六页，共84页。三、主要方法： 1、HLA血清学分型。 2、常规PCR-SSP反应。 3、SBT分型法： (1)PCR扩增DRB1片段。 (2)用ABI-373型自动测序仪测序。 (3)测序数据分析及分型。第二十七页，共84页。 结果和讨论一、进行PC
11、R-SSP法HLA-DRB1位点分型：第二十八页，共84页。第二十九页，共84页。第三十页，共84页。4、荧光定量PCR技术原理： 第三十一页，共84页。图3、荧光定量PCR中反应前的模板浓度与Ct值成反比第三十二页，共84页。n图4、15 R-II号样本荧光定量分型结果第三十三页，共84页。n图5、SSP分型结果与上述一致第三十四页，共84页。FQ-PCR分型的优点： (1)荧光定量分型法省去了电泳分析、UVP成像的操作，简化步骤，提高自动化程度，减少了工作量。 (2)判读结果与扩增由仪器同时完成，节省了PCR后处理的时间，结果更客观。 (3)将引物的特异性和探针的特异性结合，提高了准确性。
