姚敏杰-基于磁性微粒和荧光微球的DNA检测方法研究(西北大学硕士学位答辩PPT)2007.6

《姚敏杰-基于磁性微粒和荧光微球的DNA检测方法研究(西北大学硕士学位答辩PPT)2007.6》由会员分享，可在线阅读，更多相关《姚敏杰-基于磁性微粒和荧光微球的DNA检测方法研究(西北大学硕士学位答辩PPT)2007.6（32页珍藏版）》请在文档大全上搜索。

1、西北大学硕士学位论文答辩答辩人：姚敏杰答辩人：姚敏杰专专 业：分子微生物学业：分子微生物学导导 师：陈师：陈 超超 教授教授 崔亚丽崔亚丽 教授教授西北大学硕士学位论文答辩2 西北大学硕士学位论文答辩3特异性、敏感性、样品制备和标记繁琐、仪器的研制和机械化程度不高大规模、高通量快速、自动化程度高DNA芯片技术敏感性较低特异性好bDNA技术工作量大，实际应用受到限制假阳性率较低差异杂交灵敏度低，操作繁琐复杂特异性强印迹杂交不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。操作简单，事先无需对核酸样品进行特殊处理，一张膜可同时检测多个样品斑点杂交/狭线杂交组织原位杂交操作繁琐，费

2、时耗力特异性高，可精确定位菌落原位杂交原位杂交缺点优点方法种类西北大学硕士学位论文答辩4 磁性微粒的研究始于上世纪70年代，它除具有纳米颗粒的特征外，还可以通过表面的功能基团进行修饰，共价偶联蛋白、核酸等有机/生物分子， 并且具有顺磁性，可在外加磁场的作用下快速移动和分离而广泛应用于免疫学检测、靶向载药、细胞分选、酶的固定化以及分子生物学（DNA和RNA的测序与纯化）等领域中。 技术优势技术优势灵敏度高、特异性强灵敏度高、特异性强实用性、操作性强实用性、操作性强仪器设备简单、省时省力仪器设备简单、省时省力西北大学硕士学位论文答辩5 液态悬浮芯片技术是指一项将核苷酸、抗原、抗体、受体、肽链及酶底

3、物等生物大分子结合在荧光微球表面，根据生物测定的原理，与待测样品中的相应物质发生特异性反应，然后借助流式细胞仪对检测结果进行实时定量化分析的技术。技术优势技术优势高通量、快速分析高通量、快速分析高特异性、高精确性、高灵敏度高特异性、高精确性、高灵敏度省时、省力、经济省时、省力、经济西北大学硕士学位论文答辩6RNADNA后续检测后续检测标记检测探针固相基质固相基质标记物753+53分别代表不同的碱基标记物图解引物西北大学硕士学位论文答辩8西北大学硕士学位论文答辩9实验原理实验原理探针与磁性微粒的偶联探针与磁性微粒的偶联靶片段的扩增靶片段的扩增单碱基链延伸单碱基链延伸荧光信号的引入以及结果的读取荧

4、光信号的引入以及结果的读取实验小结实验小结10A：jingwen Chen 等检测SNP原理示意图1B：本研究设计原理示意图1 jing wen Chen, Marie A. lannone et al. A Microsphere-Based Assay for Multiplexed Single Nucleotide Polymorphism Analysis Using Single Base Chain Extension J . G e n o m e R e s e a r c h . 2 0 0 0 , 1 0 : 5 4 9 - 5 5 711苯异二硫氰酸酯 丙基三甲氧基硅烷

5、A：羧基末端磁性微粒 B：氨基末端磁性微粒 C：环氧乙烷磁性微粒西北大学硕士学位论文答辩12磁性微粒的种类羧基末端磁性微粒、氨基末端磁性微粒、环氧乙烷磁性微粒、Dynal磁性微粒优选内容探针在磁性微粒表面最大偶联量探针在磁性微粒表面的偶联效率经过热处理后探针在磁性微粒表面的损失量探针在磁性微粒表面偶联所用时间选用材料的价格96 5 min 5 min+5个循环 5 min+10个循环 5 min+20个循环 5 min+30个循环 13磁性微粒优选结果1.最大偶联量和偶联效率1.5 mg磁性微粒加入量(mg)97.600.0197.200.0184.600.0266.000.010.6500.

6、010.6500.010.7900.010.4400.011 nmol羧基末端磁性微粒Dynal磁性微粒环氧乙烷磁性微粒氨基末端磁性微粒探针与磁性微粒的偶联效率(%)每毫克磁性微粒表面的探针偶联量(nmol)探针加入量(nmol)磁性微粒种类2.经过热处理后探针在磁性微粒表面的损失量2.89%4.26%15.70%64.00%2.10%3.78%19.90%55.80%1.42%3.50%23.30%53.70%1.36%2.77%31.30%47.10%0.59%1.61%28.10%24.90%羧基Dynal环氧乙烷氨基5 min+30个循环5 min+20个循环5 min+10个循环5

7、min+5个循环96 5 min磁性微粒种类热处理反应时间西北大学硕士学位论文答辩14磁性微粒种类价格（￥/mg/ml）偶联所需时间（h）辅助仪器设备羧基末端磁性微粒Dynal磁性微粒氨基末端磁性微粒环氧乙烷磁性微粒9.648.43.610.41.51.53.53.5磁性分离器（磁架）磁性分离器可控温摇床可控温摇床最终选取羧基末端磁性微粒进行后续研究西北大学硕士学位论文答辩15不对称PCR扩增反应体系与扩增条件试剂加入量终浓度上游引物0.625 L待定下游引物0.625 L待定dNTP2 L0.16 nmol/L反应缓冲液（10 Buffer）2.5 L10 mmol/LMgCl22.5 L2

8、.5 mmol/LDNA聚合酶0.5 L2.5 U无核酶水（dd H2O）14.25 L模板量2 L72 10min 955 min9430 s5530 s7230 cycles4 hold30 s16500bp250bpssDNAdsDNAM：Maker DL-2000，Y：上下游引物浓度为1:1时扩增结果，：PCR空白对照50:1：上下游引物浓度为50:1的扩增结果，75:1：上下游引物浓度为75:1的扩增结果，100:1：上下游引物浓度为100:1的扩增结果西北大学硕士学位论文答辩17补至20 L已杂交的产物各1 L10 mol/L ddTTP、ddCTP、ddGTP1 L10 mol/

9、L Biotin-ddATP0.5 LrTaq聚合酶0.8 L25 mmol/L MgCl20.8 L1 mol/L Tris-HCl（pH 9.0）加入量反应试剂磁性微粒表面的单碱基链延伸反应体系补至50 L无核酶水（dd H2O）16 L4.5 mol/L TMAC20 L不对称PCR扩增产物12 L偶联有探针的磁性微粒复合物加入量反应试剂杂交反应体系18洗涤条件的优化分别用1PBST洗涤4次、2次、1次选取最佳结果ATGC重复2次对照对照重复2次洗4次结果洗2次结果ATGC重复2次对照洗1次结果ATGC西北大学硕士学位论文答辩19波长/nm吸光度值500 bp250 bpssDNAdsD