SRAP分子标记及其在蔬菜作物上的应用.doc
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SRAP分子标记及其在蔬菜作物上的应用
来源：《中国农学通报》.-2008 (8) . -69-72作者：赵光伟等阅读次数：341
1 SRAP标记的特点
1. 1 SRAP标记的原理
该技术针对基因外显子富含GC,内含子富含AT的特点，进行特殊的引物设计。其中，上游引物对外 显子进行特异扩增，下游引物对内含子区域和启动子区域进行特异扩增。因个体不同以及物种的内含子、 启动子与间隔区长度不等而产生多态性。目前，该标记已被应用于遗传图谱构建、比较基因组学、遗传多 样性分析、分子标记等多个研究领域。
1.2引物设计
SRAP是基于PCR的分子标记系统，应遵循引物设计的基本要求：不能产生二聚体和发夹结构，GC含 正向引物：
mel： 5' -TGAGTCCAAACCGGATA-3'
me2： 5' -TGAGTCCAAACCGGAGC-3'
me3： 5' -TGAGTCCAAACCGGAAT-3'
me4： 5' -TGAGTCCAAACCGGACC-3'
me5： 5' -TGAGTCCAAACCGGAAG-3'
尽管SRAP引物可以通用，但不同的引物组合对扩增多态性影响很大。钱文成等在利用SRAP检测黄瓜 基因组多态性时发现，不同引物组合在亲本间多态性检测上存在很大差异。对于每个正向引物，在与不同 的反向引物组合时，均能产生多态性条带，引物间产生多态性的组合数较为稳定；而对于每一个反向引物, 在与不同的正向引物组合时，引物间产生多态性的组合数则存在较大差别。因此，在选择引物时，要尽可 能的增加正向引物数。
1. 3 SRAP 的 DNA 扩增
SRAP进行DNA扩增时，前5个循环要求94°C变性Imin, 35°C退火Imin, 72°C延伸Imin；后35个循 环将退火温度提高到50°Co降低第一次退火温度可以增强引物和模板的结合。第二次退火温度的提高保证 了扩增产物的特异性，降低了非特异片段的比率。然而，不同物种或同一物种不同部位的材料扩增时对最 适退火温度和退火时间的要求也有差异。有研究认为，复性时间和温度比变性温度和延伸时间对扩增效果 影响大。
目前，大白菜、甘蓝、黄瓜、番茄、甜菜、西瓜的SRAP反应体系已经建立。在建立反应体系时，主 要围绕dNTP、模板、Taq聚合酶、引物、Mg2+浓度等影响因素进行研究。尽管他们在上说法不一。大多数 学者都认为，dNTP、Taq聚合酶、Mg2+三者对扩增结果的影响都很大，不同的模板浓度扩增效果差别不大。 进行PCR产物检测时，多数研究者选择6%的非变性聚丙量35%〜55%。引物大小是决定实验成功与否的关 键，Li等发现引物过短，虽然增条带丰富，但稳定性差；引物过长；放射自显影时背景较深。最终将最适 引物长度确定为上游17bp,下游18bpo其中，上游引物5'端开始的10个碱基为填充序列，加上CCGG 组成核心序列，3'端为3个选择性碱基，进行外显子扩增，下游引物5'端的填充序列为11个碱基，加 AATT组成核心序列，3'端也由3个选择性碱基组成，主要扩增内含子区域。下面是Li等开发的SRAP标 准引物：
反向引物：
eml： 5' -GACTGCGTACGAATTAAT-3'
em2： 5' -GACTGCGTACGAATTTGC-3'
em3： 5' -GACTGCG
来源：《中国农学通报》.-2008 (8) . -69-72作者：赵光伟等阅读次数：341
1 SRAP标记的特点
1. 1 SRAP标记的原理
该技术针对基因外显子富含GC,内含子富含AT的特点，进行特殊的引物设计。其中，上游引物对外 显子进行特异扩增，下游引物对内含子区域和启动子区域进行特异扩增。因个体不同以及物种的内含子、 启动子与间隔区长度不等而产生多态性。目前，该标记已被应用于遗传图谱构建、比较基因组学、遗传多 样性分析、分子标记等多个研究领域。
1.2引物设计
SRAP是基于PCR的分子标记系统，应遵循引物设计的基本要求：不能产生二聚体和发夹结构，GC含 正向引物：
mel： 5' -TGAGTCCAAACCGGATA-3'
me2： 5' -TGAGTCCAAACCGGAGC-3'
me3： 5' -TGAGTCCAAACCGGAAT-3'
me4： 5' -TGAGTCCAAACCGGACC-3'
me5： 5' -TGAGTCCAAACCGGAAG-3'
尽管SRAP引物可以通用，但不同的引物组合对扩增多态性影响很大。钱文成等在利用SRAP检测黄瓜 基因组多态性时发现，不同引物组合在亲本间多态性检测上存在很大差异。对于每个正向引物，在与不同 的反向引物组合时，均能产生多态性条带，引物间产生多态性的组合数较为稳定；而对于每一个反向引物, 在与不同的正向引物组合时，引物间产生多态性的组合数则存在较大差别。因此，在选择引物时，要尽可 能的增加正向引物数。
1. 3 SRAP 的 DNA 扩增
SRAP进行DNA扩增时，前5个循环要求94°C变性Imin, 35°C退火Imin, 72°C延伸Imin；后35个循 环将退火温度提高到50°Co降低第一次退火温度可以增强引物和模板的结合。第二次退火温度的提高保证 了扩增产物的特异性，降低了非特异片段的比率。然而，不同物种或同一物种不同部位的材料扩增时对最 适退火温度和退火时间的要求也有差异。有研究认为，复性时间和温度比变性温度和延伸时间对扩增效果 影响大。
目前，大白菜、甘蓝、黄瓜、番茄、甜菜、西瓜的SRAP反应体系已经建立。在建立反应体系时，主 要围绕dNTP、模板、Taq聚合酶、引物、Mg2+浓度等影响因素进行研究。尽管他们在上说法不一。大多数 学者都认为，dNTP、Taq聚合酶、Mg2+三者对扩增结果的影响都很大，不同的模板浓度扩增效果差别不大。 进行PCR产物检测时，多数研究者选择6%的非变性聚丙量35%〜55%。引物大小是决定实验成功与否的关 键，Li等发现引物过短，虽然增条带丰富，但稳定性差；引物过长；放射自显影时背景较深。最终将最适 引物长度确定为上游17bp,下游18bpo其中，上游引物5'端开始的10个碱基为填充序列，加上CCGG 组成核心序列，3'端为3个选择性碱基，进行外显子扩增，下游引物5'端的填充序列为11个碱基，加 AATT组成核心序列，3'端也由3个选择性碱基组成，主要扩增内含子区域。下面是Li等开发的SRAP标 准引物：
反向引物：
eml： 5' -GACTGCGTACGAATTAAT-3'
em2： 5' -GACTGCGTACGAATTTGC-3'
em3： 5' -GACTGCG
SRAP分子标记及其在蔬菜作物上的应用
