乳腺癌原位和骨转移靶向载体研究.doc

乳腺癌原位和骨转移靶向载体研究.doc乳腺癌原位和骨转移靶向载体研究
研究生：董坚
导师：李世和
中文摘要
目的：建立表达GFP的MDA-MB-231乳腺癌细胞骨转移动物模型，应用pC89 噬菌体肽库体技术，筛选能特异性进入乳腺癌MDA-MB-231原代细胞及骨转移 细胞的小肽，探讨其作为肿瘤靶向治疗载体的可行性，为提高乳腺癌骨转移治疗 率及探讨乳腺癌体化治疗提供实验依据。
方法：将带有GFP表达基因的质粒PEGFP-N2采用脂质体转染法转染入处于对 数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231 ,获得稳定表达GFP的 MDA-MB-231/GFP细胞。扩增培养MDA-MB-231/GFP细胞，左心室注射裸鼠每 只1X107个/0.2ml。45天后，小鼠行X线/PET-CT检查，确定骨转移部位。并同 时取部分转移灶进行组织培养并在荧光显微镜观察细胞表达GFP情况。扩增培 养PC89噬菌体肽库，使其扩增后的滴度达10nTUo将原代乳腺癌细胞以及从转 移灶取得的乳腺癌细胞的肿瘤与pC89噬菌体肽库体外共培养。Subtilisin被用于 灭活未进入细胞的噬菌体,进入细胞的特异性小肽噬菌体经细胞裂解、转化E.coli XLI-Blue得到扩增。经过五轮的反复共培养和扩增，富集得到能特异性进入乳 腺癌细胞的小肽噬菌体。选用RGD-integrin binding噬菌体作为对照，分别检测 乳腺癌细胞特异性小肽噬菌体与MDA-MB-23K其他乳腺癌细胞株、其他组织 来源实体瘤细胞株以及正常细胞株的亲和性。测序并合成无噬菌体外壳蛋白的特 异性多肽并标记FITC,排除噬菌体外壳蛋白以及氨基酸序列在特异性转导中的 作用。将编码乳腺癌细胞特异性多肽的DN***段定向插入能够表达GST融合蛋 白的质粒pGEX-2T,构建原核表达载体,小肽与GST融合蛋白表达用SDS-PAGE 和Western-blot进行鉴定，抗GST单克隆抗体免疫荧光检测小肽介导GST蛋白
进入人乳腺癌原代细胞或从转移灶取得的乳腺癌细胞的能力，探讨特异性小肽作
为靶向载体的携带能力。
结果：用PEGPF-N2转染入人乳腺癌细胞MDA-MB-231后，获得稳定表达细胞 进行裸鼠心腔注射，62.5%的裸鼠出现胸廓和肋骨等处的转移。将亲代 MDA-MB-231细胞和转移灶MDA-MB-231细胞分别与PC89噬菌体库体外培养, 筛选获得五个能特异性进入靶细胞的小肽噬菌体，经DNA测序确定它们分别是 CASPSGALRSC (P I ) , CFPVPGHDEVC (PII ) , CFSVPGHDIVC (PIII), CYTYPLGWHIC (PIV)和 CTPMSLSLSEC (PV)。嵌合蛋白(RGD-integrin) 作为阳性对照研究发现，筛选的小肽噬菌体与其他大多数肿瘤细胞及正常细胞无 特殊亲和性；P I显示与亲代细胞和转移灶细胞均能高特异性结合，而PII主要 与转移灶细胞高特异性结合，并发现它们在细胞中的分布主要以核周为主。进一 步研究发现噬菌体外壳蛋白对小肽的特异亲和性无影响，合成的无噬菌体外壳蛋 白的多肽序列保持与原代细胞及及转移细胞的亲和特异性。成功构建 pGEX-2T-P I和pGEX-2T-PH原核表达载体，并在大肠杆菌中分别表达融合蛋白 P I -GST和融合蛋白P