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1、Gene engineering主讲：潘训海主讲：潘训海手机：手机：13990078512Email ：2010.7基因工程内容简介内容简介基因工程，是生命科学的核心学科之一。它以类似于工程学的方法与技术，对生命元件进行设计、构建、组装和应用，有目的地改造生物物种生产出人们所期望的生命物质。基因工程技术的显著特点是，打破了常规育种难以突破的物种界限，使原核、真核生物之间，动植物之间，以至人与其他生物之间的遗传信息进行重组和转移。本课程主要介绍基因工程概述、基因工程操作原理（从基因的表达调控机制入手，将DNA重组技术归纳为切、接、转、增、检五大基本操作单元）、基因工程应用（按照受体细胞的生物学分
2、类，逐一展开各系统基因工程的原理和应用）。基因工程的地位基因工程的地位基因基因工程工程生命科学生命科学分子分子生物学生物学生物生物工程工程Field after one round of application of Roundup herbicideTransgenic tomato plants show resistance (left) while non-transformed plants are susceptible to cucumber mosaic virus under field conditions (right)http:/www.apsnet.org/onlin
3、e/feature/BioTechnology/Images/2.4.jpgInsect infestation on Bt (right) and non-Bt (left) cotton bollshttp:/www.colostate.edu/programs/lifesciences/TransgenicCrops/images/cotton.jpgWild-type corn showing infestation - Bt corn is resistant to thisPotatoes are one of many plants being used to produce v
4、accineshttp:/ rice and normal (white) wsjbiotech.html嗯？！真的？预防传染病！还不快吃愣什么！植物？动物？植物？动物？物种？物种？1. 基因工程概述（2）2. 分子克隆工具酶（3）3. 分子克隆载体（2）4. 人工染色体载体（1）5. 表达载体（2）6. 基因工程技术（8）7. 基因工程应用（8）8. 基因工程产品的安全及其管理（2）9.答疑及课程考核（2）授课内容及学时安排授课内容及学时安排组成部分：组成部分： 平时考勤：平时考勤：10% 课外作业：课外作业：20% 期末考查：期末考查：70%作业要求作业要求： 按时完成按时完成 独立思考独
5、立思考 书写整齐书写整齐成绩考核成绩考核第一章第一章 基因工程概述基因工程概述主要教学内容主要教学内容1.1 基因工程与基因操作的基本概念1.2 基因工程的诞生与发展1.3 基因工程的研究内容1.4 基因操作的理论基础1.5基因工程的应用1.6 基因工程的安全性掌握基因工程的基本概念；熟悉基因工程的主要研究内容，发展历程；了解基因工程的应用及安全性。重点与难点重点与难点基因工程的概念及研究内容；基因工程技术的特点。教学目标与要求教学目标与要求教学要求教学要求1.与传统育种相比，基因工程育种有哪些特点和优势？2.简述基因工程的主要步骤。3.基因工程技术存在哪些潜在危害？4.简述基因的结构组成对基
6、因操作的影响。需掌握专业词汇需掌握专业词汇gene engineering；clone。问题与思考问题与思考1.1 基因工程的基本概念基因工程的基本概念1.1.1重组重组DNA技术的基本定义技术的基本定义 重组重组DNA技术技术是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克分子克隆技术。隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 (1)基因工程： 通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动。 另:指重组DNA技术的产业化设
7、计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）； 下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 (2)基因操作： 指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。1.1.2 基因工程的基本定义基因工程的基本定义（1） DNA是遗传物质是遗传物质肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验, 1944年 Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。噬菌体转染实验噬菌体转染实验, 1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA。1.2 基因
8、工程的诞生与发展基因工程的诞生与发展1.2.1 基因工程诞生的理论基础基因工程诞生的理论基础1953年年James D. Watson和和Francis H. C. Crick揭示揭示了了DNA分子的分子的双双螺旋结构螺旋结构和和半保半保留复制机制。留复制机制。(2) DNA双螺旋结构双螺旋结构英国英国 NATURE杂志杂志 1953年年4月月25日日 “脱氧核糖核酸的结构脱氧核糖核酸的结构” 沃森，克里克沃森，克里克 1962年年12月月10日日 诺贝尔奖颁奖仪式诺贝尔奖颁奖仪式 中关村中关村街头雕街头雕塑塑脱氧脱氧核糖核糖碱基碱基磷酸磷酸A G C T基本单位脱氧核苷酸DNA的结构 鸟嘌呤
9、脱氧核苷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸胞嘧啶脱氧核苷酸P脱氧脱氧核糖核糖AP脱 氧脱 氧核糖核糖TP脱氧脱氧核糖核糖GP脱氧脱氧核糖核糖C四种脱氧核苷酸：四种脱氧核苷酸： 腺嘌呤脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸脱氧核苷酸的连接脱氧核苷酸的连接P脱氧脱氧核糖核糖含氮碱基含氮碱基P脱氧脱氧核糖核糖含氮碱基含氮碱基ATGCATGCDNADNA双链的连接DNA分子的立体结构分子的立体结构-规则的规则的双螺旋结构双螺旋结构1.双链、反向平行双链、反向平行2.外侧：外侧：脱氧核糖和脱氧核糖和磷酸交替连接磷酸交替连接-基本骨架基本骨架3.内侧：内侧：碱基对碱基对碱基互补
10、配对原则碱基互补配对原则G=C ; A=T1957年年Crick又提出了遗传信息传递的又提出了遗传信息传递的“中心法则中心法则” DNA RNA protein1964年年Marshall Nirenberg和和Gobind Khorana等终于等终于破译了破译了64个遗传密码个遗传密码(3) 中心法则和遗传密码中心法则和遗传密码遗传物质应具备的特点：遗传物质应具备的特点：1.携带大量遗传信息携带大量遗传信息；2.自我复制自我复制、从亲代到子代、从亲代到子代传传递递遗传信息；遗传信息；3.能够让遗传信息得到能够让遗传信息得到表达表达，控制细胞代谢活动，控制细胞代谢活动，控制控制生生物物性状；性
11、状；4.能够能够突变并保留突变并保留突变；突变；-DNA分子碱基对排列分子碱基对排列顺序的多样性顺序的多样性（1 ） 限制性内切酶（限制性内切酶（restriction enzymes）1970年年H.O. Smith等分离出第一种限制等分离出第一种限制性核酸内切酶。性核酸内切酶。Werner Arber 理论预见限制酶Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断1.2.2 基因工程诞生的技术突破基因工程诞生的技术突破1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。（3）载体（载体（vector）1972年前后使用小分子量的
12、细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。（4 ）感受态体系感受态体系1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。（2）DNA连接酶（连接酶（ligase）1970年Baltimore等人和Temin等人同时各自发现了逆转录酶。（6）琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开。（7）DNA测序技术测序技术1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术。（5 ）逆转录酶）逆转录酶（1）
13、Berg的开创性实验的开创性实验1972年斯坦福大学的年斯坦福大学的Paul Berg小组完小组完成了首次体外重组实验：成了首次体外重组实验：将将SV40的的DNA片断与片断与 噬菌体的噬菌体的DNA片断连接起来。片断连接起来。1.2.3 基因工程的诞生基因工程的诞生1973年斯坦福大学的S. Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。（2）Boyer-Cohen
14、实验实验pSC101（1）目的基因的获取目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或或PCR扩增等步骤，分离出带有扩增等步骤，分离出带有目的基因目的基因的的DNA片断。片断。（2）重组体的制备重组体的制备将目的基因的将目的基因的DNA片断插入到能片断插入到能自我复自我复制制并带有并带有选择性标记选择性标记（抗菌素抗性）的（抗菌素抗性）的载载体体分子上。分子上。1.3 基因工程的研究内容基因工程的研究内容(步骤）步骤）(4)克隆鉴定克隆鉴定挑选挑选转化成功的细胞克隆（含目的基因）。转化成功的细胞克隆（含目的基因）。(5)目的基因表达目的基因表达使导入寄主细
15、胞的目的基因表达出我使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。们所需要的基因产物。(3)重组体的转化重组体的转化基因工程基本过程基因工程基本过程1.41.4 基因的结构基因的结构- -基因操作的理论基础基因操作的理论基础 基因是遗传信息的基本单位。基因是遗传信息的基本单位。基因是一段核苷酸序列；可以是连续的，也可以基因是一段核苷酸序列；可以是连续的，也可以是不连续的；可以是是不连续的；可以是DNA也可以是也可以是RNA；可以存；可以存在于染色体上，也可以存在于染色体之外（如质在于染色体上，也可以存在于染色体之外（如质粒等）。基因具有可分性、重叠性和可变性。粒等）。基因具有可分性、重叠
16、性和可变性。 什么是基因？1.基因是存在于细胞内有自我繁殖能力的遗传单位. 2.基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段. 3.编码一个RNA或一条多肽链的DNA片段称为一个基因. 4.基因是生物体遗传的基本单位,存在于细胞的染色体上,作直线排列. 5.基因是生物体内一切具有自主复制能力的最小遗传功能单位,其物质基础是一条以直线排列具有特定核苷酸序列的核酸片段.下面收录了对下面收录了对基因基因的五个定义的五个定义 （1）共线性）共线性 基因决定蛋白质的序列组成，是由密码子基因决定蛋白质的序列组成，是由密码子对应特定氨基酸所决定的。当一个基因的核苷酸对应特定氨基酸所决定的。当一个基因的
17、核苷酸序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表序列与其产物的氨基酸序列是一一对应时，则表明它们是共线性的。明它们是共线性的。 （2） 基因及其产物的非共线性基因及其产物的非共线性 由于真核生物的断裂基因具有内含子，使由于真核生物的断裂基因具有内含子，使得得一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列一个基因的核苷酸序列与其产物的氨基酸序列不是一一对应关系，则表明基因及其产物是非共不是一一对应关系，则表明基因及其产物是非共线性的。线性的。 ATG GCG GCT GCC GGT GCT CTC TTT TTC CTA TTC TCC TCC TTC TGC Met Ala Ala Ala Gly
18、Ala Leu Phe Phe Leu Phe Ser Ser Phe CysATG GCG GCT GCC GGT GCT CTC TTT TTC CTA TTC TCC TCC TTC TGC Met Ala Ala Ala Gly Ala.Phe Ser Ser Phe Cys1.4.3 基因及其产物的共线性与非共线性基因及其产物的共线性与非共线性DNA的复制过程1 ） 基因制药基因制药 通过DNA重组技术将天然存在于人体内起着各各种生理功能种生理功能且含量甚少以至微量的活性多肽、蛋白质、糖肽所编码的基因片断基因片断导入微生物或哺乳动物细胞中进行扩增和表达,通过纯化、提取制备出高纯度、高
19、活性的生物有效物质。1.5 基因工程的应用基因工程的应用1.5.1 基因工程在医药上的应用基因工程在医药上的应用1976年，27岁的风险投资人Robert Swanson与 University of California的教授Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（Genetic Engineering Technology）。 1982年,首次批准重组动物疫苗-抗球虫病疫苗。 1982年,第一个基因工程药物-人胰岛素生产上市。生物活性多肽生物活性多肽单克隆抗体单克隆抗体疫苗疫苗三大类基因药物产品三大类基
20、因药物产品:制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。 将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。2 ） 基因治疗基因治疗1 ） 提高植物的光合作用效率提高植物的光合作用效率 提高提高CO2的固定率的固定率改变与光合作用有关的酶的结构和组成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。 提高光能吸收率和转化率提高光能吸收率和转化率改变光能交换系统的分子的基因结构。1.5.2 基因工程在农业生产中的应用基因工程在农业生产中的应用使非固氮植物转变为固氮植物或能与根瘤菌共生固氮。3
21、 ） 转基因植物转基因植物是农业生物技术的主要内容。 是将克隆到的特殊基因导入受体植物，使之增加一些优质性状（高产、稳定、优质、抗虫、抗病等）。2 ） 提高豆科植物的固氮效率提高豆科植物的固氮效率上市的转基因产品上市的转基因产品 将外源基因导入动物细胞，并在基因组内稳定整合，遗传给后代。 改善子代特性；研究遗传性疾病的动物模型；使动物成为生物反应器生产有用的活性蛋白等。4 ） 转基因动物转基因动物大鼠生长激素基因转入小鼠大鼠生长激素基因转入小鼠1 ） 纤维素的开发利用纤维素的开发利用克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生入
22、酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。产葡萄糖，发酵成酒。2 ） 酿酒工业酿酒工业用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。1.5.3 基因工程在工业中的应用基因工程在工业中的应用1 ） 检测水污染检测水污染用重组细菌或转基因鱼等检测水污染。用重组细菌或转基因鱼等检测水污染。2 ） 生物降解生物降解用带有重组质粒的用带有重组质粒的“超级菌超级菌”分解油（烷烃分解油（烷烃类）、有机农药污染。类）、有机农药污染。1.5.4 基因工程在环境保护中的应用基因工程在环境保护中的应用1976 Gen
23、entech Genentech创立1977 首次在微生物中生产了人蛋白生长激素抑制素1978 克隆了人胰岛素基因1979 克隆了人生长激素基因1980 公司上市，募集$ 35million1982 第一个基因重组药（人胰岛素）上市1985 第一个自己生产的产品（人生长激素）1987 生产组织纤溶酶原激活剂（TPA）1990 生产interferon 1Genentech的骄人业绩的骄人业绩基因工程试剂的高回报基因工程试剂的高回报 碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子 231元元/ug 红细胞生成素红细胞生成素 1072元元/ug 白细胞介素白细胞介素-2 410元元/ug 巨细胞粒细
24、胞集落刺激因子巨细胞粒细胞集落刺激因子 1960元元/ug 胰岛素胰岛素 10.2元元/mg1 ） 对环境的影响对环境的影响重新组合一种在自然界尚未发现的的生物性状重新组合一种在自然界尚未发现的的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。有可能给现有的生态环境带来不良影响。2 ） 新型病毒的出现新型病毒的出现制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。传播。1.6 基因工程的安全性基因工程的安全性1.6.1 基因工程的安全隐患基因工程的安全隐患将肿瘤病毒或其它动物病毒
25、的将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入细引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。菌有可能扩大癌症的发生范围。4 ） 人造生物扩散人造生物扩散新组成的重组新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。会出现不同程度的潜在危险。3 ） 癌症扩散癌症扩散1 ） 公众的担忧公众的担忧1973年美国的公众第一次公开表示担心年美国的公众第一次公开表示担心应用重组应用重组DNA技术可能会培养出具有潜在技术可能会培养出具有潜在危险性的新型微生物，从而给人类带来难危险性的新型微生物，从而给人类带来难以预料的后果。以预料的后果。1.6.2 重组重组DNA研究的安全准则研究的安全准则
26、1974年美国国立卫生研究院（年美国国立卫生研究院（NIH）考虑）考虑到重组到重组DNA的潜在危险，提请的潜在危险，提请Paul Berg博士博士组成一个重组组成一个重组DNA咨询委员会。咨询委员会。 这个由这个由1111名分子生物学和重组名分子生物学和重组DNADNA权威学者组权威学者组成的委员会在同年成的委员会在同年7 7月发表公开信（月发表公开信（science, science, 158,303158,303），要求在没有弄清楚重组），要求在没有弄清楚重组DNADNA所涉及所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（措施
27、之前，暂停两类试验（带抗生素抗性和肿带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒瘤病毒及动物病毒）。）。2 ） 专家的态度专家的态度1976年6月23日，NIH正式公布了“重组DNA研究的安全准则”。规定了安全防护（物理防护和生物防护）标准以及禁止若干类型的实验。 1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放宽了许多限制。3） 制定安全规则制定安全规则 实验室的物理安全实验室的物理安全分4级：P1P4级。 实验室的生物安全实验室的生物安全分3 级（大肠杆菌）：EK1EK3级。 载体的安全载体的安全应该是失去了自我迁移的能力。生物安全生物安全本章应掌握的内容 基因工程的概念及特点。 基因工程理论理论上的三大发现和技术上的三大发明。 基因工程的主要步骤。 基因工程技术的潜在危害性。
