第九章表观遗传学研究实验技术简介

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1、第九章 表观遗传学研究实验技术 简介染色体免疫共沉淀技术DNA甲基化分析技术染色体免疫共沉淀技术染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation. ChIP)是基于体内分析发展起来的方法，也称结合位点分析法，可用于测定体内结合在特定DNA序列上的蛋白质。该方法主要应用于体内核小体定位、DNA甲基化、组蛋白修饰等方面的研究。染色体免疫共沉淀技术染色质免疫沉淀技术的原理是:在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，超声破碎将染色质随机切断为一定长度范围内的染色质片段，用所要研究的目的蛋白特异性抗体沉淀交联复合体，再经过蛋白质与DNA解除偶联，纯化目的片段并检测。C

2、hIP技术的步骤(1)细胞固定:在活细胞状态下，用甲醒固定蛋白质 DNA复合物，甲醒能有效地使体内的蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA产生交联。其中使用甲醛作为交联剂的关键优势在于甲醒交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中分别对DNA和蛋白质进行分析。也可以使用紫外光作为交联剂来固定细胞，它比化学交联剂产生更少的干扰，但难以广泛应用。(2)化学(微球菌酶)或者超声破碎断裂染色质:通常采用超声波打断染色质，使其成一定大小的片段。目前一般认为500-1000bp的大小范围是比较合适的。(3)染色质的免疫沉淀z利用目的蛋白质特异抗体通过抗原-抗体反应形成DNA蛋白质抗体复合体，然后沉淀此

3、复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段;抗体的量要进行优化，防止非特异的结合，同时要设立相应的阴性对照，以验证抗体的有效性和抗原抗体反应的特异性。ChIP技术的步骤ChIP技术的步骤(4)解除交联和纯化DNA:在免疫沉淀复合体中加入不含DNase的RNase和蛋白酶K(也可以不加蛋白酶K.解除交联后回收DNA.蛋白还可用于做进一步的分析). 65保温6小时使交联解除，得到DNA.并进行DNA的纯化。(5) DNA的检测:可以采用PCR、Southern杂交、ChIP克隆、DNA芯片等方法进行DNA的检测。ChIP on chipChIP on chip将ChIP操作与基因芯片技术分析法(

4、chip)相结合，是研究目的蛋白质与基因组中DNA相互作用位点的一种全基因组定位方法。实验步骤为： 用甲醒固定细胞 超声破碎细胞 特异抗体通过免疫沉淀富集与目的蛋白质交联的DNA片段 解交联ChIP on chip 用LM-PCR扩增富集的DNA片段并用荧光染料(Cy5)进行标记;未经免疫沉淀富集的DNA片段也用LM-PCR扩增，但是用另一种荧光染料(Cy3)标记扩增产物。 将这两组标记的DNA与一张含有全基因序列的DNA芯片进行杂交。 从3次独立的实验获得的免疫沉淀富集的荧光强度与未经免疫沉淀富集的荧光强度的比值用加权平均分析法计算目的蛋白质与芯片中的每一段序列的相对结合度。ChIP-Seq

5、ChIP-Seq技术将ChIP与第二代测序技术相结合，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。其原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建;然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序；最后将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。DNA甲基化分析技术 DNA甲基化是表现遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。随着对甲基化研究的不断深入，其检测方法也层出不穷。这些方法针对不同研究目的，运

6、用不同的处理方法，几乎涵盖了从基因到基因组各个层次水平的研究。DNA甲基化分析技术 研究方法：甲基化敏感的限制性内切酶法 重亚硫酸盐的甲基化分析方法研究目的：基因组整体水平甲基化分析 特异性位点的DNA甲基化检测 甲基化新位点的寻找DNA甲基化分析技术研究方法：甲基化敏感的限制性内切酶法一些限制性内切酶的识别位点中含有CpG双核苷酸序列，他们往往只能结合非甲基化的识别序列，而对发生甲基化的序列则没有结合活性。这种方法不仅可以用来检测某个基因或DNA序列的甲基化状态，而且可以用作整个基因组甲基化状态的筛查。在这个原理基础上设计的研究方法有：RLGS (restriction landmark g

7、enome scanning，限制性标志物全基因组扫描)、DMH (differential methylation hybridization for methylation analysis.差异性甲基化杂交分析)、MCA Cmethylation CpG island amplification for methylation analysis，甲基化CpG岛扩增子分析)DNA甲基化分析技术重亚硫酸盐的甲基化分析方法其原理是：用重亚硫酸氢钠在碱性条件和氢醌的催化下处理DNA可使非甲基化的胞嘧啶发生脱氨反应，从而转变成尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶不能发生脱氨反应，因而仍保留为胞嘧啶。DN

8、A甲基化分析技术研究目的：基因组整体水平甲基化分析高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，测量254nm处的吸收峰值，计算内/ (5mC+5C)的积分面积就得到基因组整体的甲基化水平。这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示目的片段中CpG位点甲基化的情况。但存在的问题是不能对甲基化的CpG位点进行定位。免疫化学法此方法基于单克隆抗体能够与5mC发生特异性反应的原理。应用荧光素 标记抗体使之与预先己固定在DEAE膜上的样品DNA特异性结合，对DEAE膜上的荧光素进行扫描得到5mC的水平，其荧光素强度

9、与5mC水平成正比。这种方法较为灵敏但需要精密仪器。DNA甲基化分析技术Sssi甲基转移酶法原理：S-腺昔甲硫氨酸(SAM)在Sssi甲基转移 酶催化作用下使基因组DNA的CpG位点发生甲基化，在体系中加人一定量的3H-S-腺苦甲硫氨酸(3H-SAM)及Sssi甲基转移酶反应后，测定剩余的放射性标记的S灿4即可得到原基因组整体甲基化水平，即测到的放射性强度与所测DNA甲基化水平成反比。这种方法的缺点是Sssi甲基转移酶不稳定，结果不够精确，另外这种方法也是对DNA的整体CpG位点的甲基化情况检测，不能精确定位。DNA甲基化分析技术氯乙醛法首先，将DNA经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞唔院全部转变

10、为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变(Frommer et ai， 1992)，然后经过银或色谱柱去除DNA链上的嘌呤，再将样品与氯乙醛共同孵育，这样5mC就转变为带有强荧光的乙烯胞嘧啶，荧光的强度与原5mC的水平成正比。这种方法可以直接测定基因组整体5mC水平。其优点是所用试剂价格低廉且稳定性好，避免了放射性污染，但缺点是费时费力，而且氯乙醛是一种有毒的物质。DNA甲基化分析技术特异性位点的DNA甲基化检测甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism， MSAP)实验原理:由于Hpall和MsI的识别序列相同(5-CCG

11、G-3)，但对甲基化的程度不同，即Hpall不能切割双链甲基化的5mCCGG， C5mCGG和5mC5mCGG，但能切基化的序列，而MsI能切割C5mCGG但不能切害5mCCGG序列，因此CCGG发生甲EcoRI/Hall和EcoRI/MsI的酶切、扩增产物产生多态性。通过比较电泳谱带的差异，可以推测CCGG的甲基化情况。DNA甲基化分析技术重亚硫酸盐直接测序法原理：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，之后进行PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生申基化。此方法