齐全版(荧光PCR技术)
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1、实时荧光定量实时荧光定量PCR技术技术与普通与普通PCR的区别（一）的区别（一）v普通普通PCR技术：技术： 在在PCR结束后对结束后对终点产物终点产物进行定量分析。进行定量分析。v实时定量实时定量PCR技术：技术：实时检测实时检测PCR扩增，在扩增的扩增，在扩增的指数期指数期对对起始模板进行定量。起始模板进行定量。起始定量与终点定量起始定量与终点定量起始起始DNA量是量是“天然天然”的量，更有意义；终的量，更有意义；终点点DNA量是经过量是经过PCR“加工加工”，存在部分失真，存在部分失真起点定量重现性好；终点定量误差大起点定量重现性好；终点定量误差大由于由于PCRPCR扩增效率的差异使得相
2、同扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大的差异的样品扩增结果存在很大的差异相同模板进行相同模板进行9696次扩增的扩增曲线图次扩增的扩增曲线图与普通与普通PCR的区别（二）的区别（二）荧光实时定量PCR定量原理vPCR每进行1个循环，DNA呈2倍的指数关系增长，不久达到平台期。起始DNA量越多扩增产物量便越早达到检出值，也就是扩增曲线越早起峰。我们将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real Time PCR，就会按照起始DNA量由多到少得顺序等间隔得到一系列扩增曲线。再由Ct值与起始模板的对数值之间存在的线性关系，就可以制作成下图标示的标准曲线。未知浓度的样品与标准品相同，检测未知样品CT值
3、，并将其代人标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模板量，这就是Real Time PCR的定量原理。在实时荧光定量在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化反应中，引入了一种荧光化学物质，随着学物质，随着 PCR 反应的进行，反应的进行， PCR 反应产物不反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线荧光扩增曲线 实时荧光实时荧光扩增曲线图扩增曲线
4、图扩增曲线的描述vPCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶的失活，dNTP和引物的枯竭，反应副产物焦磷酸对合成反应的阻害等原因，致使PCR并非一直呈指数扩增，而最终将进入平台期。荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，
5、扩增产物已不再呈指数级的增加，数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此应选择这个阶段进行定量分析。系，因此应选择这个阶段进行定量分析。 几个定义几个定义线性基线期为扩展最初的线性基线期为扩展最初的1015个循环，此时，个循环，此时，PCR反应处于起始阶段，扩增产物很少，所产生反应处
6、于起始阶段，扩增产物很少，所产生的荧光信号很低。的荧光信号很低。什么是荧光域值（什么是荧光域值（threshold）PCR反应的前反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的个循环的荧光信号的标准差的10倍倍，即：，即： threshold = 10 SDcycle 3-15 几个定义几个定义什么是什么是 Ct 值值 C代表代表Cycle，t代表代表thresholdCt值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
7、有实验证明所经历的循环数。有实验证明Ct值大小与样本中的原始拷贝值大小与样本中的原始拷贝数成反比关系。数成反比关系。Ct值是实时荧光值是实时荧光PCR的主要定量参数的主要定量参数几个定义几个定义C(t) value 定量的分类v绝对定量方法绝对定量方法：绝对定量方法相对简单。绝对定量是使用已知浓度的标准品制作标准曲线，对未知浓度的样本进行绝对量（拷贝数）测定的方法。v相对定量方法相对定量方法：相对定量方法相对复杂，一般用于基因表达解释。首先应分别测定目的基因和参比基因的量，再求出对应参比基因的目的基因的相对量，最后再进行样品间相对量的比较。Ct值与起始模板的关系值与起始模板的关系 每个模板的每
8、个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系系，起始拷贝数越多，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表横坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。每一扩增周期后产物的量可以用下式表示每一扩增周期后产物的量可以用下式表示定量定量PCR的数学原理的数学原理y=x(1+e)ny：产
9、物分子数：产物分子数 x：起始分子数：起始分子数e：扩增效率：扩增效率 n：循环次数：循环次数 在扩增产物到达阈值线时：在扩增产物到达阈值线时： Xct=X0(1+Ex)Ct=Y （1）XctXct：荧光扩增信号到达阈值信号强度时扩增产物的：荧光扩增信号到达阈值信号强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后，它是一个常数，设为量，在阈值线设定以后，它是一个常数，设为Y Y。方程式（方程式（1）两边同时取对数得：）两边同时取对数得： Y= X0(1+Ex)Ct （2）整理方程（整理方程（2）得：）得： X0=(1+Ex) * *Ct+Y （3）最后结论最后结论： X0与与Ct呈线性关系，根据样品设置的
10、呈线性关系，根据样品设置的Ct值就可计算出样品中所含的模板量。值就可计算出样品中所含的模板量。 I I二、荧光定量二、荧光定量PCR标记检测类型标记检测类型SYBR GREEN Iv荧光嵌合法通常使用SYBR Green I。SYBR Green I是一种能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。它与PCR合成的双链DNA结合，在激发光照射下产生荧光，荧光染料结合到双链DNA后荧光信号增加1000倍，通过荧光强度的检测，可以实时监测PCR扩增的产物量。荧光嵌合检测法原理荧光嵌合检测法原理融解曲线：融解曲线：采用采用SYBR GREEN I荧光嵌合法检测时，可以荧光嵌合法检
