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1、波谱分析第八章第八章核磁共振原理及其核磁共振原理及其在生物学中的应用在生物学中的应用 第二讲第二讲 核磁共振的主要参数核磁共振的主要参数化学位移化学位移耦合常数耦合常数峰强峰强横向驰豫时间横向驰豫时间纵向驰豫时间纵向驰豫时间线宽线宽核欧佛豪斯效应（核欧佛豪斯效应（NOENOE）化学位移化学位移的定义化学位移的定义化学位移和分子结构化学位移和分子结构 化学位移的定义化学位移的定义 核磁共振的共振条件是核磁共振的共振条件是 = H0同一种原子核，由于旋磁比相同，因而在相同外磁场下只应有一个共振频率。同一种核在分子中同一种核在分子中不同化学环境下共不同化学环境下共振频率的位移称为振频率的位移称为化学
2、位移化学位移 = B0/2 化学位移产生的原因化学位移产生的原因 原子核处于分子内部，分子中运动的电子受到外磁场的作用，产生感生电流。这一感生电流在核上产生感生磁场感生磁场，感生磁场与外磁场相互叠加，使核上受到的有效场发生变化。我们把这一现象称为核受到了屏蔽屏蔽。屏蔽作用的大小可用屏蔽因屏蔽因子子 来表示 HtotalH0H0 (1 )H0 抗磁性物质抗磁性物质顺磁性物质顺磁性物质 化学位移的表示方法化学位移的表示方法 实际工作中测量的都是相对的化学位移，即以某一参考物的谱线为标准。最常用的参考物是四甲基硅(CH3)4Si，简称TMS 因为化学位移的大小与磁场强度成正比，为了比较在不同场强谱仪
3、的化学位移，实际工作中常用一种与磁场强度无关的，无量刚的值（相对值），无量刚的值（相对值）， ，来表示化学位移的大小，来表示化学位移的大小 HHHppmrefsamref106 samrefrefppm106高场低频，低场高频。其实这是对于两种不同的扫描方式高场低频，低场高频。其实这是对于两种不同的扫描方式而言的，不要混淆而言的，不要混淆；同一环境的质子有相同的化学位移值。；同一环境的质子有相同的化学位移值。屏蔽增强低场高频高场低频化学位移的表示方法化学位移的表示方法 为什么用TMS作为基准? CH3SiH3CCH3H3CAromaticIminesAmidesHCb b, , , . HCa
4、 awater10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0化学位移化学位移的定义化学位移的定义化学位移和分子结构化学位移和分子结构 化学位移和分子结构的关系化学位移和分子结构的关系分子中电子对核的屏蔽作用是化学位移形成的原因。屏蔽的大小和外加磁场的大小、核的种类、核所处化学键的类型、核周围邻近的化学基团以及其它分子的相互作用都有关系 局部逆磁作用局部顺磁作用邻近基团的磁各向异性范德华效应溶剂作用 氢键效应pH的影响 局部逆磁作用局部逆磁作用-1-1s电子对核的屏蔽电子对核的屏蔽 Lamb首先计算了球对称的s态电子对核的屏蔽。在外磁场的作用下，诱导产生感生电流。这一感生电流产生一个与外磁场方向相
5、反的诱导磁场，它使核上所受到的有效磁场减小,即使核受到了屏蔽, 产生了高场位移。若电子密若电子密度增加，度增加， d增加，屏蔽增加，引增加，屏蔽增加，引起高场位移；若减少电子密度，起高场位移；若减少电子密度， d减少，屏蔽减少，引起低场位减少，屏蔽减少，引起低场位移移 局部逆磁作用局部逆磁作用-2-2诱导效应诱导效应即相连原子或基团的电负性对核化学位移的影响：即相连原子或基团的电负性对核化学位移的影响：附近的附近的吸电子基团吸电子基团使核周围的电子云密度降低，屏蔽效应也使核周围的电子云密度降低，屏蔽效应也降低，去屏蔽增加，降低，去屏蔽增加，化学位移向低场移动化学位移向低场移动 附近的附近的推电
6、子基团推电子基团使核周围的电子云密度增加，屏蔽效应也使核周围的电子云密度增加，屏蔽效应也增加，增加，化学位移向高场移动化学位移向高场移动 例如在CH3X中，CH3 的化学位移值与取代基X的电负性Ex有显著的依赖关系： 局部逆磁作用局部逆磁作用-3-3共轭效应共轭效应：在具有多重键或共轭多重键的分子体系中，由于电子的转移,导致某基团电子密度和磁屏蔽的改变p-共轭 (推电子给邻位) -共轭(从邻位拉电子)邻近基团的磁各向异性邻近基团的磁各向异性当分子中一些基团的电子云排布不是球形对称，即在磁场中具有磁各项异性时，它对邻近的质子就附加一个各向异性的磁场，使某些位置的质子处于该基团的屏蔽区，化学位移值
7、移向高场，而另一些位置的质子处于该基团的去屏蔽区，化学位移移向低场。质子没有局部顺磁屏蔽作用质子没有局部顺磁屏蔽作用非氢原子的局部顺磁屏蔽作用往往很重要 各种系统的化学位移各向异性在苯环的上方和下方出现屏蔽区，而在苯环平面上出现去屏蔽区。三键环电子流产生的感应磁场沿键轴方向为屏蔽区。双键平面上方和下方的质子处于电子云屏蔽区，而双键平面内的质子处于去屏蔽区。邻近基团的磁各向异性邻近基团的磁各向异性-1-1环流效应环流效应：由于苯环电子的离域性，在外磁场H0的作用下，当H0的方向垂直于苯环平面时， 电子便沿着苯环碳链流动，形成所谓环电流，电子流动的结果产生磁场，感应磁场的方向与H0 相反 芳烃质子
8、的=7.30ppm烯烃质子的=5.25ppm环流效应的存在与否可作为化合物有无芳香性的判据邻近基团的磁各向异性邻近基团的磁各向异性-2-2双键和羰基的屏蔽双键和羰基的屏蔽醛基质子位于去屏蔽区，加上由于羰基电负性引起的去屏蔽效应因此其共振峰出现在低场位置(9.2-10.5ppm) 邻近基团的磁各向异性邻近基团的磁各向异性-3-3三键的屏蔽三键的屏蔽 乙炔质子位于正屏蔽区，因此其共振峰出现在高场区( =1.8ppm) 范德华效应范德华效应 范德华效应范德华效应：两个原子相互靠近时，由于受到范德华力的作用，电子云相互排斥，导致原子周围的电子密度降低，屏蔽减少，谱线向低场方向移动氢键效应氢键效应 氢键
9、形成对质子化学位移的影响不能简单予以解释。当H和Y形成氢键X-HY时，一方面的存在使X-H键的电子云密度降低而去屏蔽，化学位移增加。另一方面，给体原子或基团的磁各向异性可能使质子受到屏蔽，化学位移减少。其中去屏蔽作用是主要的，所以观测到的是氢键氢键形成低场位移形成低场位移 溶剂效应溶剂效应 由于溶剂与溶质分子间的相互作用，使得在不同溶剂下的溶质分子的化学位移不同 CDCl3和CCl4等溶剂对化合物的值基本上没有影响芳香性的溶剂，如C6H6，C6D6或C5H5N, 则变化较大 对于OH, SH, NH2和NH等活泼氢而言，溶剂效应更为强烈 在烯醇型中存在着分子内部氢键，这种具有内部氢键的质子共振
10、峰往往出现在低场有内部氢键的质子共振峰往往出现在低场位置上，其 值可高达15-19ppm 氢键对于生物大分子构象研究非常重要氢键对于生物大分子构象研究非常重要氢键是维持生物大分子构象的一种重要的相互作用研究氢键通常有下面几种方法：测定酰胺质子-NH的H-D交换速率 观察溶剂变化时化学位移所受到的影响 跟踪酰胺质子化学位移随温度的变化 pHpH的影响的影响 不同pH下分子的带电状态不同，而不同带电状态下基团中质子共振峰的位置也不同H NCRHCOOHH N-CRHCOOH NCRHCOO3+H3OH2+- 偶合常数基本原理基本原理 偶合常数和生物大分子构象偶合常数和生物大分子构象 CHCH3 3
11、CHCH2 2OHOH质子质子谱的精细结构谱的精细结构一、自旋偶合与自旋裂分一、自旋偶合与自旋裂分 spin coupling and spin splittingspin coupling and spin splitting 每类氢核不总表现为单峰，有时多重峰。原因：相邻两个氢核之间的自旋偶合（自旋干扰）；一般在3个键之内发生由自旋偶合所引起的谱线增多的现象称为自旋裂分。峰的裂分峰的裂分峰的裂分原因: 相邻两个氢核之间的自旋偶合多重峰的峰间距：偶合常数（J），用来衡量偶合作用的大小。二、峰裂分数与峰面积二、峰裂分数与峰面积 number of peak splitting and peak
12、 areasnumber of peak splitting and peak areas 峰裂分数：n+1 规律；n为相邻碳原子上的质子数； 系数符合二项式(a+b)n的展开式系数；峰裂分数峰裂分数C CH3HC CH HH1:11:3:3:11:11:2:1峰裂分数峰裂分数CCCHaHcBrHbHbHcHbHaHa裂分为多少重峰？01234JcaJbaJca JbaHa裂分峰:(3+1)(2+1)=12实际Ha裂分峰:(5+1)=6强度比近似为：1:5:10:10:5:1三 偶合常数（J） 自旋自旋偶合，可反映相邻核的特征，可提供化合物分子内相接和立体化学的信息。NMR的直接信息nJHX表
13、达方式：偶合原子相隔键数偶合常数 自旋偶合产生峰裂分后，两峰之间的距离称为偶合常数J。单位： 赫兹Hz，一般不超过20 Hz 1.同碳偶合同碳偶合 指间隔2个单键的质子之间的偶合，即连在同一个碳上的2个质子之间的偶合。用 2J 表示CHHC=CHHJ= 12 15J = 0 3 J 的大小表示偶合作用的强弱，它是化合物结构的属性，不随外磁场的变化而变化。(Karplus公式)3J=A+Bcos+Ccos2(A=7 B=-1 C=5)CCHHNMR的直接信息2.2.邻碳偶合邻碳偶合 指间隔3个单键的质子之间的偶合，即相邻2个碳上的质子之间的偶合。用 3J 表示例如， H-C-C-H 3J=59H
14、z3J的大小与2个质子之间的夹角有关，J =J0 cos2J180 cos2 - 0.28(= 00 900 )= 900 1800 ) - 0.28J180 J0烯键邻位氢：顺式（0）J = 6 14 反式（180 ）J = 11 18 CCR1R2HaHbCCR1HaR2Hb反式 (trans)顺式 (cis)3Jab=14-18HzHaHb3Jab=10-14HzHaHbNMR的直接信息3.3.远程偶合远程偶合 指间隔3个键以上的质子之间的偶合，这种偶合对体系较为重要。HHHHXXC=CHaHbCHcJ 邻 = 6 10J 间 = 1 3J 对 = 0.2 1.5J ac = 0 1.5
15、J bc = 1.6 3.03Jab=7-94Jac=1-35Jad=0.5R1HcHaHdR3R2HbHcHaR1R3R2HaHcHdHaHbHcHaHbHcNMR的直接信息R3HcHaR1HdR2HbHcHaHdl自旋偶合具有相互性：nJxy= nJyx ( J 值相同)l偶合是固有的，只有当相互偶合的核化学位移不等时，才会表现出偶合裂分l偶合强弱( J 值大小)与原子核间所隔的化学键多少（n）有关 通常1H核之间的偶合出现在 n 3，当它们之间有双键存在时，n = 4-5，也会出现偶合（远程偶合）。 不同的原子核会有些差别。4.4.一般规律一般规律四、磁等价与磁不等价四、磁等价与磁不等价
16、 magnetically equivalent and nonequivalentmagnetically equivalent and nonequivalent1. 化学等价（化学位移等价） 若分子中两个相同原子（或两个相同基团）处于相同的化学环境，其化学位移相同，它们是化学等价的。相反，化学位移不同的核称为化学不等价。例如： CH3CH2X 中的CH3 的3个H，是化学等价的， CH2中的2个H，是化学等价的， 而甲基和亚甲基的H是化学不等价核 （2）CH3CH3（3）CH3CH2OCH2CH3 分子中相同种类的核（或相同基团），不仅化学位移相同，而且还以相同的偶合常数与分子中其它的核
17、相偶合，只表现一个偶合常数，这类核称为磁等价的核。例如：CHHHCHHFFCH2C CHHHHHH三个H核化学等价磁等价二个H核化学等价，磁等价六个H核化学等价磁等价2. 2. 磁等价磁等价两核（或基团）磁等价的条件两核（或基团）磁等价的条件首先必须是化学等价（化学位移相同）必须对组外任一个核具有相同的偶合常数（数值和键数）Ha，Hb化学等价，磁不等价。J Ha FaJ Hb FaFa，Fb化学等价，磁不等同。C CHaHbFaFbYH2H3H4H2H33J5JCOH3CNHHXYH2H3H2H3磁不等同例子：五、五、NMRNMR图谱的类型图谱的类型J 61. 一级谱（简单谱）一级谱必须满足2
18、个条件：（1）两组相互偶合的氢核的化学位移的差值与其偶合常数的比值满足：例：CHCl2-CH2Cl中CH =5.85，CH2 =3.96，J=6.5Hz，在60兆周的仪器上 =（5.85-3.96) 60=113.4Hz， /J=17仪器兆周数（2）相互偶合的两组氢核中，每组中的氢核必须是磁全同核1. 裂分峰数符和n+1规律，相邻的核为磁等价即只有一个偶合常数J；若相邻n个核中有n1个核偶合常数为J1， n2个核偶合常数为J2，n= n1+ n2 则裂分峰数为（n1+1)( n2+1)q2. 峰组内各裂分峰强度比(a+b)n的展开系数q3. 从谱图中可直接读出 和 J。q4. 化学位移 在裂分
19、峰的对称中心，裂分峰之间的距离（Hz）为偶合常数 J一级谱的特点一级谱的特点v一般情况下，谱峰数目超过n+1规律所计算的数目v组内各峰之间强度关系复杂v一般情况下， 和 J 不能从谱图中可直接读出2. 二级谱 /J 6六、自旋体系六、自旋体系分子中相互偶合的许多核构成一个自旋体系分子中相互偶合的许多核构成一个自旋体系1.自旋体系的表示方法（1）一个自旋体系中化学等价的核构成一个核组，用一个大写英文字母表示，若这些核虽然化学位移一样，但磁不等价，则在字母右上角加撇。（2）化学不等价的核用不同的大写英文字母表示，当它们的化学位移值相差大，如一级谱，则用相差较远的字母表示。A、B、C； K、L、M.
20、； X、Y、Z.（3）每一种磁等价的核的个数写在字母右下角。（4）写自旋体系时，I=1/2的非氢核也要写入。例如：CH3CH2OH A3M2X 13CH2F2 AM2X2HHHClClHAABB2. 自旋体系分类(1) AX系统（a）AX系统有4条线，A，X各为两重峰；（b）两峰之间裂距为偶合常数JAX；（C）各组双重峰的中点为该核的化学位移；（d）四条谱线高度相等。AXJAXJAXVXVA（2）AX2 系统（a）AX2 系统有五条谱线，A 受两个质子的偶合分裂成三重峰，X 受 A 的偶合分裂成两重峰。（b）两重峰及三重峰的裂分峰之间的裂距为偶合 常数 JAX（C）两组峰的对称中心为化学位移。
21、（d）A组三重峰强度比为 1：2：1；X 组强度比为 1：1。例如，CHCl2CH2Cl（3）AMX 系统（a）在AMX系统中任何两核之间的化学位移之差都应远大于它们之间的偶合常数。 AM 远大于JAM， AX 远大于JAX， MX 远大于JMX。AMX系统有12条线，其中A、M、X各占4条，四条谱线强度相等。（b）十二条谱线有三种裂距，分别对应为JAM、JAX、JMX。每个质子的四条谱线有两种裂距，分别为该原子与其他两个原子的偶合常数。（c）每组四重峰的中点为该核的化学位移。C CHACNHBHCJCAJBCJBA画法IJCBJAC画法IIAMX系统JABAABBJACJABJBAJBCBC
22、CCJCBJCAC CHACNHBHC（4） A2X2 系统（a）共有六条谱线，A2 和 X2 各为三条谱线。（b）每组三条谱线中的两条相邻谱线间的距离为JAX 。（ c）三条谱线的中点为化学位移。（d）每组三条谱线的强度比为1：2：1。Ph-CH2-CH2-O-CO-CH3两个CH2例如（5）AX3 系统（a）常见的AX3系统为 有六条谱线，A为四重峰，X为双峰。CH CH3（b）A的四重峰两条相邻谱线间距离等于X两谱线间距离，等于JAX。（c）每组谱线中央为化学位移。（d）A 的4条线强度比为1：3：3：1，X 的两条谱线强度比为1；1。(6) A2X3系统共7条谱线，A 为4条， X 为
23、3条， A 的强度比为1：3：3：1， X 的为1：2：1例如，CH3CH2OH RCOOCH2CH3耦合常数的分类耦合常数的分类 同核耦合常数 异核耦合常数 近程耦合常数 远程耦合常数 单键耦合常数1J 同碳耦合常数2J 邻位耦合常数3J 自旋耦合的传递过程中，两端的核一定要具有核自旋，但中间的核却不一定但中间的核却不一定 耦合常数和生物大分子构象耦合常数和生物大分子构象耦合常数的分类耦合常数的分类 多肽构象多肽构象 多肽构象多肽构象 多肽是由多个氨基酸组成的，氨基酸之间通过肽键（酰胺键）连接，肽键具有部分双键性质，不能自由旋转 多肽主链的二面角多肽主链的二面角 A-B-C-D定义二面角，C
24、-D相对A-B顺时针转为正，逆时针转为负，重叠为零邻位耦合常数邻位耦合常数J J 和二面角和二面角 Karplus关系 3JAcos2+Bcos+Csin2 角和角和 角角的关系的关系L氨基酸 ：=-60 角和角和 角角的关系的关系D氨基酸 ：=+60 因此每一个 角对应于2个 角，而对于大多数3JH-N-Ca-H，每一个耦合常数3JH-N-Ca-H又对应于二个 值, 因此有四个可能的 角对应于观察到的3JH-N-Ca-H值 Karplus-Bystov关系式和构象能的计算相结合，或简单地和构象能图相结合可以帮助正确选择可能的二面角 对L-氨基酸来说： 右手a螺旋 3JH-N-Ca-H3.9H
25、z (-57) 310螺旋 3JH-N-Ca-H4.2Hz (-60) 反平行b折叠 3JH-N-Ca-H8.9Hz (-139) 平行b折叠 3JH-N-Ca-H9.7Hz (-119)峰强、驰豫和线宽峰强、驰豫和线宽 峰峰 的的 数数 目目: 标志分子中磁不等性质子的种类，多少种；标志分子中磁不等性质子的种类，多少种； 峰的强度峰的强度(面积面积)比比: 每类质子的数目每类质子的数目(相对相对)，多少个，多少个； 峰峰 的的 位位 移移 值值(): 每类质子所处的化学环境、化合物中位置；每类质子所处的化学环境、化合物中位置； 峰峰 的的 裂裂 分分 数数 : 相邻碳原子上质子数；相邻碳原子
26、上质子数； 偶偶 合合 常常 数数 (J): 确定化合物构型。确定化合物构型。非电磁辐射形式非电磁辐射形式释放能量释放能量驰豫现象：驰豫现象：高能态的核以非辐射形式释放能量，回高能态的核以非辐射形式释放能量，回到低能态，维持到低能态，维持n0略大于略大于n*，致使核磁共，致使核磁共振信号存在，这种过程称为振信号存在，这种过程称为“驰豫驰豫”。驰豫现象是驰豫现象是NMR得以保持的必要条件。得以保持的必要条件。由于受到由于受到核外电子云的屏蔽作用，无法通过碰撞释放能量。核外电子云的屏蔽作用，无法通过碰撞释放能量。吸收电磁辐射吸收电磁辐射1.0000099*0 kTEenn纵向驰豫（纵向驰豫（T1T
27、1）纵向驰豫是高纵向驰豫是高能原子核将其能原子核将其多余能量交给多余能量交给周围介质而返周围介质而返回低能态的过回低能态的过程。程。高能态核平均高能态核平均寿命有关的一寿命有关的一个量，并强烈个量，并强烈受体系运动性受体系运动性影响。影响。横向驰豫（横向驰豫（T2T2）横向驰豫是由于磁场不均等因素引起的磁化矢量的相移。横向驰豫是由于磁场不均等因素引起的磁化矢量的相移。由于磁场的不均一，会导致谱线增宽。线宽为横向驰豫时由于磁场的不均一，会导致谱线增宽。线宽为横向驰豫时间的倒数。分子翻滚速率、溶液粘度和分子内部运动性等间的倒数。分子翻滚速率、溶液粘度和分子内部运动性等影响线宽。影响线宽。Backb
28、one dynamics of the tandem zincfinger domain of Stc1R2/R1 is related to the overall tumbling of the protein.核核OverhauserOverhauser效应（简称为效应（简称为NOENOE）是指对分子中两个空间距离较近的原子核中其中一个进行激是指对分子中两个空间距离较近的原子核中其中一个进行激发，使其共振达到饱和，这时另外一个原子核的核磁共振峰发，使其共振达到饱和，这时另外一个原子核的核磁共振峰的强度，与没有辐射相邻原子核时相比，发生改变的现象。的强度，与没有辐射相邻原子核时相比，发生改
29、变的现象。弛豫过程中的交叉弛豫（弛豫过程中的交叉弛豫（cross-relaxationcross-relaxation）是核）是核OverhauserOverhauser效应产生的原因。效应产生的原因。NOENOE效应是通过空间而不是通过化学键传递。效应是通过空间而不是通过化学键传递。NOENOE效应的大小效应的大小与原子核之间距离的六次方成反比。与原子核之间距离的六次方成反比。一般，一般，NOENOE效应要求两种效应要求两种质子的空间距离小于质子的空间距离小于5A5A，从而帮助判断分子的空间结构。，从而帮助判断分子的空间结构。 一维谱一维谱共振峰强度随频率（化学位移）变化共振峰强度随频率（化学位移）变化核磁双共振核磁双共振双核自旋系统双核自旋系统检测器2扰动扰动1脉冲双共振是同时用两种频率的射频场作用在两种核组成的系统上，第一射频场B B1使某种核共振，第二射频场B B2使另外一种核共振，这样两个原子核同时发生共振。第二射频场为干扰场，通常用一个强射频场干扰图谱中某条谱线，另一个射频场观察其他谱线的强度、形状和精细结构的变化，从而确定各条谱线之间的关系，区分相互重叠的谱线。二维核磁共振的基本思路多维谱多维谱
