第八章 分子杂交技术
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1、第八章第八章分子杂交技术分子杂交技术第一节第一节 分子杂交的原理分子杂交的原理核酸分子杂交核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。按碱基配对原则形成双链的过程。 分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键非共价键（主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链 不同来源的不同来源的DNA或或RNA单链在一定条件下单链在一定条
2、件下重新组成的新的双链分子重新组成的新的双链分子杂交分子杂交分子 若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果。但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短（如2030个核苷酸），则难免会出现准确性差的假阳性现象。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。已知核酸序列称探针。杂交的双方：探针和要检测的核酸。 将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。被检测的核酸： 克隆化的基因组DNA 提纯的 细胞总DNA 细胞内杂交（细胞原位杂交） 细胞总RNA DNA
3、-DNA杂交双链分子杂交双链分子 杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。（一）（一）DNA变性变性 1、定义：某些理化因素导致两条、定义：某些理化因素导致两条DNA链间链间的氢链断裂变为单链的过程，称的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性变性l2、变性的方法：、变性的方法：l（1）热变性：温度升高到）热变性：温度升高到90100时，双链时，双链核酸核酸 分子链间的氢键完全断裂。分子链间的氢键完全断裂。l （2）酸碱变性：）酸碱变性：pH值低于值低于3或高于或高于10时，双时，双链核酸分子链链核酸分子链 间的氢键断裂。间的氢键断裂。l （3）化学试剂变性：如
4、尿素、甲酰胺、甲醛）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。双链核酸分子链间的氢键断裂。GC含量与含量与Tm值之间的关系值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3l（二）复性（二）复性l 1、定义：变性的单链核酸分子在一、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。链核酸的过程，称复性或杂交。l具有互补序列的两条单链核酸都可互补具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：形成双链：lDNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、
5、寡核苷酸寡核苷酸/DNA和寡核苷酸和寡核苷酸/RNA。2、复性过程、复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列中心序列（4）形成完整的双链分子）形成完整的双链分子待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸固化滤膜上核酸固化杂杂 交交去除未参与杂交的探针去除未参与杂交的探针检检 测测 杂杂 交交 信信 号号制备探针核酸片段制备探针核酸片段探探 针针 标标 记记加入标记核酸探针加入标记核酸探针 电泳电泳 制备制
6、备DNA或或RNA样品样品与固定基质结合与固定基质结合80真空固定真空固定预杂交预杂交加入标记探针杂交加入标记探针杂交洗涤洗涤放射自显影或显色反应。放射自显影或显色反应。探针（探针（Probe)Probe)的概念的概念: : 一段带有检测标记的与目的基因或目一段带有检测标记的与目的基因或目的的DNA特异互补的已知核苷酸序列。特异互补的已知核苷酸序列。长度一般以长度一般以50300bp为宜，有时达为宜，有时达1.5kb。制备方法：制备方法： (1) DNA重组技术重组技术 (2) PCR扩增扩增 (3) 化学合成化学合成2. 探针的分类探针的分类 据来源及性质不同可分为：据来源及性质不同可分为：
7、 (1) 基因组基因组DNA探针探针 (2) cDNA探针探针 (3) RNA探针探针 (4) 寡核苷酸探针寡核苷酸探针(1) (1) 长度（长度（10-50 bp); 10-50 bp); (2) G:C(2) G:C对含量对含量40%-60%40%-60%；(3) (3) 探针内避免互补；探针内避免互补；(4) (4) 避免同一碱基连续出现；避免同一碱基连续出现；(5) (5) 与非靶序列有与非靶序列有70%70%以上同源性或连续以上同源性或连续8 8个以上碱基序列相同，最好不用。个以上碱基序列相同，最好不用。 为确定为确定探针是否与相应基因组探针是否与相应基因组DNADNA杂交杂交，有必
8、要，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。信号。 同位素：同位素： 3232P P、3535S S、3 3H H、125125I I等标记探针等标记探针非同位素：非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物 l按其分子种类划分按其分子种类划分（1）Southern印迹杂交印迹杂交（2）Northern印迹杂交印迹杂交3） Western印迹杂交印迹杂交按待测核酸是否固定在固相支持物上分：按待测核酸是否固定在固相支持物上分：l 固固-液相杂交液相杂交 膜上印迹杂交膜上印迹杂交 原位杂交原位杂交l
9、 液相杂交液相杂交 RNA酶保护分析法酶保护分析法 核酸酶核酸酶S1保护分析法保护分析法l其基本原理是将待检测的其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交的位置上显示出杂交信号。通过信号。通过Southern杂交可以判断被检测的杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。段的长度。lDNA经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为D
