工科分析化学第十讲高效液相色谱法专业级随堂讲义

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1、第十章第十章 高效液相色谱法高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 10101 1 概述概述 一、一、高效液相色谱法高效液相色谱法概述概述 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优吸取了气相色谱与经典液相色谱优点点，并用现代化手段加以改进。，并用现代化手段加以改进。它是在它是在经典液相色谱经典液相色谱基础上，基础上，引入了引入了气相色谱的理论气相色谱的理论，在，在技术上技术上采用了高压泵、高效固定相采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，和高灵敏度检测器，因而具备因而具备速度快、效率高

2、、灵敏度高、操速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的作自动化的特点特点，因此得到迅猛的发展。因此得到迅猛的发展。目前已成为应用极为目前已成为应用极为广泛的化学分离分析重要手段。广泛的化学分离分析重要手段。二进样系统二进样系统 高效液相色谱柱高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多比气相色谱柱短得多（约（约530cm），所），所以柱外展宽（又称柱以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。进外效应）较突出。进样系统是引起柱前展样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对高效液相色谱法中对进样技术要求较严。进样技术要求较严。 进样装置进样装置： 注射器进样；注射器进样； 高压定量进样阀高

3、压定量进样阀；三、分离系统三、分离系统色谱柱色谱柱 色谱柱包括柱管与固定相两部分。柱管材料有色谱柱包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜，内衬光滑的聚合材料。玻玻璃、不锈钢、铝、铜，内衬光滑的聚合材料。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5 530cm30cm，内径为，内径为4 45mm5mm，凝胶色谱柱内径，凝胶色谱柱内径3 312mm12mm，制备柱内径较大，可达制备柱内径较大，可达25mm 25mm 以上。以上。一般在分离前备一般在分离前备有一个有一个前置柱前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，前置柱内填充物和分离柱

4、完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响保证分离柱的性能不受影响。 1 1高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较 高速：高速：在分析速度上比经典液相色谱法在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍快数百倍。由。由于于经典经典色谱是色谱是重力加料重力加料，流出速度极慢；而，流出速度极慢；而高效液相高效液相色谱色谱配备了配备了高压输液高压输液设备，流速最高可达设备，流速最高可达 10103 3cmcmm

5、inmin-1-1. . 例如例如分离氨基酸，用经典色谱法，柱长约分离氨基酸，用经典色谱法，柱长约170cm170cm，柱，柱径径0.9cm0.9cm，流动相速度为，流动相速度为30cm30cm3 3h h-1-1，需用，需用2020多小时才能多小时才能分离出分离出2020种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lhlh之之内即可完成；内即可完成；高效：高效：其柱效可达其柱效可达3 3万塔板万塔板/ /米以上（气相色谱约米以上（气相色谱约2000 2000 塔板塔板/ /米），分离效率大大提高了。米），分离效率大大提高了。四检测系统四检测系统 在液相色谱中，有两种基

6、本类型的检测器。一类是在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶溶质型检测器质型检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是另一类是总体检测器总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检示差折光，电导检测测器等。器等。p163（l）紫外检测器）紫外检测器 （2）荧光检测器）荧光检测器 （3）示差折光率检测器）示差折光率检测器（4）电导检测器）电

7、导检测器 2 2高效液相色谱法与气相色谱法的比较高效液相色谱法与气相色谱法的比较 （l l）气相色谱法气相色谱法分析对象只限于气体和沸点较低的化合物，分析对象只限于气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的它们仅占有机物总数的2020。对于占有机物总数近。对于占有机物总数近8080的那的那些高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质，些高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质，目前主要采用目前主要采用高效液相色谱法高效液相色谱法进行分离和分析；进行分离和分析； (2)(2)气相色谱气相色谱采用流动相是采用流动相是惰性气体惰性气体，它，它与组分不产生相与组分不产生相互作用力，

8、仅起互作用力，仅起运载作用运载作用。而。而高效液相色谱高效液相色谱法中法中流动相对组流动相对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争，分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用，因此，流动相对分离起很大作用，因此，可选用不同极性的液体可选用不同极性的液体，选择余地大，相当于选择余地大，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便；这为选择最佳分离条件提供了极大方便； （3）气相色谱一般都在）气相色谱一般都在较高温度较高温度下进行的，而高效液相色下进行的，而高效液相色谱法则经常可在谱

9、法则经常可在室温条件室温条件下工作；下工作； 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要的主要缺点缺点。 二、二、 影响液相色谱分离的因素影响液相色谱分离的因素 气相色谱所讨论的气相色谱所讨论的基本概念及基本理论基本概念及基本理论，如：保留，如：保留值，分配系数，分配比，分离度，塔板理论，速率理值，分配系数，分配比，分离度，塔板理论，速率理论等论等与液相色谱一致与液相色谱一致，但液相色谱流动相为液体，其，但液相色谱流动相为液体，其扩散系数，粘度，密度等与气体均有很大的扩散系数，粘度，密度等与气体均有很大的差别差别，都，都将对色谱分

10、析过程产生影响。将对色谱分析过程产生影响。 三、提高液相色谱分离效率的措施三、提高液相色谱分离效率的措施1、采用、采用小而均匀小而均匀的填料（担体），减小的填料（担体），减小dp, 2、减小减小填料填料孔穴深度孔穴深度，且，且孔径大孔径大；3、用、用低粘度低粘度溶剂作流动相；溶剂作流动相；4、适当、适当降低降低流动相流动相流速流速；5、适当、适当提高柱温提高柱温；6、减小减小柱前柱后柱前柱后死体积死体积。10102 2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 高效液相色谱仪一般可分高效液相色谱仪一般可分为为4 4个主要部分个主要部分：高压输液系高压输液系统，进样系统，分离系统和统，进样系统，分离系统和检

11、测系统检测系统, ,另有另有辅助装置：如辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据梯度淋洗，自动进样及数据处理等。处理等。其其工作过程工作过程如下：如下：首先高压泵将贮液器中流动首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱相溶剂经过进样器送入色谱柱，当注入欲分离的样品时，柱，当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。到液相色谱图。 一高压输液系统一高压输液系统 由于