第十六章 高效液相色谱法

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1、1第第16章章 高效液相色谱分析法高效液相色谱分析法high performance liquid chromatograph216-1 16-1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点1. 特点：高压、高效、高速、自动化特点：高压、高效、高速、自动化 与气相色谱比较：与气相色谱比较：n适合于分子量大、高沸点、热不稳定有机及生化试样，适合于分子量大、高沸点、热不稳定有机及生化试样， 离子型化合物和高聚物的分离分析。离子型化合物和高聚物的分离分析。n液体流动相参与分离过程，选择性高。液体流动相参与分离过程，选择性高。n固定相类型多，分析选择余地大。固定相类型多，分析选择余地大。n较低的柱温，有

2、利于色谱分离。较低的柱温，有利于色谱分离。n液体扩散性小，纵向扩散可忽略。液体扩散性小，纵向扩散可忽略。n试样易于制备及回收。试样易于制备及回收。n仪器复杂昂贵。仪器复杂昂贵。n液相色谱高柱效的原因液相色谱高柱效的原因: :以特殊方法用小粒径的填料（以特殊方法用小粒径的填料（3 35um5um球形）制备色谱柱球形）制备色谱柱nH=He+Hd+Hm+Hs+Hsm =A+B/u +Cmu+Csu+Csmu 由于溶质分子在溶剂中的扩散系数很小，纵向扩散由于溶质分子在溶剂中的扩散系数很小，纵向扩散可以忽略。可以忽略。 因此因此B B项可以略去。项可以略去。nH=A+（Cm+Cs+Csm）unA=2dA

3、=2dp pn 2.液相色谱中速率理论液相色谱中速率理论0.01 k0.01 k2 2 (1+ k(1+ k) )2 2 Cm =dp2 Dm 416-2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪流程及主要部件流程及主要部件流程流程组成系统：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测和记录系统组成系统：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测和记录系统516-2-1 高压输液系统高压输液系统（1） 高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：15015035035010105 5 PaPa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10 ) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙

4、腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷 氯仿氯仿 溴乙烷溴乙烷 苯苯 四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳 环环己烷己烷 己烷己烷 煤油煤油( (最小最小) ) 溶剂强度溶剂强度指溶剂将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。溶剂指溶剂将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。溶剂强度与溶剂的极性有关。正向色谱中溶剂极性越大溶剂强度强度与溶剂的极性有关。正向色谱中溶剂极性越大溶剂强度越大。反相色谱反之。越大。反相色谱反之。 17（2 2）溶剂要与检测器匹配。）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸

5、收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。外截止波长要长。 对于折光率检测器，要求选择与组对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。（3 3）高纯度）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪伪峰峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50501OOnm1OOnm。（4 4）化

6、学稳定性好）化学稳定性好。避免与样品或固定相发生反应或聚合。避免与样品或固定相发生反应或聚合。（5 5）低粘度）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。（6 6） 试样在流动相中应有适宜的溶解度，试样在流动相中应有适宜的溶解度，若试样组分的若试样组分的分配比分配比K K值范围很广，则采

7、用梯度洗脱。值范围很广，则采用梯度洗脱。18一、液一、液- -固吸附色谱固吸附色谱二、液二、液- -液分配色谱液分配色谱三、化学键合相色谱三、化学键合相色谱四、离子交换色谱四、离子交换色谱五、排阻色谱五、排阻色谱六、亲和色谱六、亲和色谱( (AC)AC)主要分离类型与原理主要分离类型与原理1916-3 16-3 液液-固吸附色谱固吸附色谱liquid-solid adsorption chromatography 固定相固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是使用的是5 51010mm的硅胶吸附剂；的硅胶吸附剂； 流动相流动相：各种不同极性的一

8、元或多元溶剂。：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性；有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；2016-4 16-4 液液-液分配色谱液分配色谱liquid- liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理基本

9、原理：组分在固定相和流动相上的分配组分在固定相和流动相上的分配； 流动相流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（动相的极性小于固定液的极性（正相正相 normal phasenormal phase），），流流动相的极性大于固定液的极性（动相的极性大于固定液的极性（反相反相 reverse phasereverse phase）。）。正正相与反相的出峰顺序相反；相与反相的出峰顺序相反； 固定相固定相：（1 1）全多孔型载体）全多孔型载体 （2 2）表面多孔型载体（薄壳型微珠担体）表面多孔型载体（薄壳型微珠担体） （3

10、3）固定液）固定液 极性：极性：，-氧二丙腈，聚乙二醇氧二丙腈，聚乙二醇 非极性：十八烷（非极性：十八烷（ODSODS），角鲨烷），角鲨烷 2116-5 16-5 化学键合相色谱化学键合相色谱bonded-phase chromatography1 1键合固定相类型键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基表面的硅醇基(Si(Si一一OH)OH)与有机分子成键与有机分子成键, ,即可得到各种性即可得到各种性能的固定相。一般可分三类能的固定相。一般可分三类（1 1）疏水基团疏水基团 如不同链长的烷烃（如不同链长的烷

11、烃（C C8 8和和C C1818）和苯基等）和苯基等（2 2）极性基团极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3 3）离子交换基团离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季铵如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐；盐； 作为阳离子交换作为阳离子交换 基团的磺酸等基团的磺酸等. .22C18硅胶填料结构2316-5 16-5 化学键合相色谱化学键合相色谱bonded-phase chromatography 2.2.化学键合固定相特点：化学键合固定相特点：（1 1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2 2）