血清胆固醇的定量测定
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1、实验二实验二 血清胆固醇的定量测定血清胆固醇的定量测定（磷硫铁法）（磷硫铁法）一、实验目的一、实验目的1、学习并掌握磷硫铁法测定血清中、学习并掌握磷硫铁法测定血清中总胆固醇含量的原理及操作；总胆固醇含量的原理及操作；2、学会制备无蛋白血清、学会制备无蛋白血清 ；3、了解血清总胆固醇的正常值范围、了解血清总胆固醇的正常值范围及临床意义及临床意义 。二、实验原理胆固醇的分子结构3171 胆固醇主要存在于动物细胞，参胆固醇主要存在于动物细胞，参与膜的组成，质膜中的含量比细胞器与膜的组成，质膜中的含量比细胞器膜中的多。胆固醇也是血中脂蛋白复膜中的多。胆固醇也是血中脂蛋白复合体的成分；并与合体的成分；并
2、与粥样硬化粥样硬化有关，它有关，它是动脉壁上形成的粥样硬化斑块成分是动脉壁上形成的粥样硬化斑块成分之一。胆固醇也是类固醇激素和胆汁之一。胆固醇也是类固醇激素和胆汁酸的前提。酸的前提。 1784年，从胆石中提取出胆固醇。年，从胆石中提取出胆固醇。总胆固醇的测定方法： 磷硫铁法 化学比色法 醋酸酐法 邻苯二甲醛法 酶学方法（试剂盒） 用无水乙醇提取血清中的胆固醇，用无水乙醇提取血清中的胆固醇，再与磷硫铁试剂作用，产生颜色反应，再与磷硫铁试剂作用，产生颜色反应，呈色度与胆固醇含量成正比，可用比呈色度与胆固醇含量成正比，可用比色法测定血清中胆固醇含量。色法测定血清中胆固醇含量。 血清经无水乙醇处理后蛋
3、白质被沉血清经无水乙醇处理后蛋白质被沉淀，胆固醇及其脂则溶解在无水乙醇中。淀，胆固醇及其脂则溶解在无水乙醇中。在乙醇提取液中加入硫磷铁试剂（即浓在乙醇提取液中加入硫磷铁试剂（即浓硫酸和三价铁溶液），胆固醇及其脂与硫酸和三价铁溶液），胆固醇及其脂与试剂反应形成比较稳定的紫红色化合物，试剂反应形成比较稳定的紫红色化合物，呈色程度与胆固醇含量成正比，可于呈色程度与胆固醇含量成正比，可于560nm 波长下进行比色测定。波长下进行比色测定。 正常血清中胆固醇的含量有随年正常血清中胆固醇的含量有随年龄增大而增加的趋势，其平均正常值龄增大而增加的趋势，其平均正常值在在110220mg/100mL。 胆固醇含
4、量在胆固醇含量在400mg/100ml内，内，与与A值成良好线性关系。值成良好线性关系。 三、实验器材1、人血清2、可见分光光度计3、台式离心机（4000r/min）4、离心管5、试管6、移液管。四、实验试剂1、10%三氯化铁溶液：三氯化铁溶液：10.0g FeCl36H2O 溶于浓溶于浓磷酸中，定容至磷酸中，定容至100ml；2、磷硫铁试剂、磷硫铁试剂(P-S-Fe 试剂试剂)：取：取10%三氯化铁溶三氯化铁溶液液1.5ml于于100ml棕色容量瓶内，加棕色容量瓶内，加浓硫酸浓硫酸至刻至刻度；度；3、胆固醇标准贮液：准确称量胆固醇、胆固醇标准贮液：准确称量胆固醇80mg，溶于，溶于无水乙醇，
5、定容至无水乙醇，定容至100ml；4、胆固醇标准溶液：将贮液用无水乙醇准确稀释、胆固醇标准溶液：将贮液用无水乙醇准确稀释10倍即得，此标准液含倍即得，此标准液含0.08mg/mL胆固醇。胆固醇。5、无水乙醇、无水乙醇五、操作1、胆固醇的提取胆固醇的提取 吸取血清吸取血清0.1ml置干燥离心管置干燥离心管内，先加无水乙醇内，先加无水乙醇0.4ml，摇匀后，摇匀后再加无水乙醇再加无水乙醇2.0ml，摇匀，摇匀，10min后离心（后离心（3000r/min-6000r/min）5min，取上清夜备用。，取上清夜备用。2、比色测定比色测定 取干燥试管取干燥试管3支，支，编号编号，分别加入，分别加入无水
6、乙醇无水乙醇1.0ml（空白管），胆固醇标（空白管），胆固醇标准溶液准溶液1.0ml（标准管），上述乙醇提（标准管），上述乙醇提取液取液1.0ml（样品管），各管皆加入磷（样品管），各管皆加入磷硫铁试剂硫铁试剂1.0ml，摇匀，摇匀，10min后，分后，分别转移至比色杯内，用可见分光光度别转移至比色杯内，用可见分光光度计在计在560nm处比色。处比色。 管号/试剂空白管标准管测定管无水乙醇1.0ml胆固醇标准液1.0ml乙醇抽提液1.0ml磷硫铁试剂1.0ml1.0ml1.0mlA560 注：注：磷硫铁试剂须磷硫铁试剂须沿管壁沿管壁缓缓加入，缓缓加入，与乙醇液分成两层，立即迅速振与乙醇液分成两
7、层，立即迅速振摇摇20次，放置次，放置10分钟（冷却至室分钟（冷却至室温）后，于温）后，于560nm进行比色，以进行比色，以空白管调零读取各管吸光度。空白管调零读取各管吸光度。六、计算100ml血清中胆固醇的质量（血清中胆固醇的质量（mg） A1C0 m= 0.04100 A0注意事项：1、颜色反应与加磷硫铁试剂混合时的产热颜色反应与加磷硫铁试剂混合时的产热程度有关，因此，所用试管程度有关，因此，所用试管口径和厚度要口径和厚度要一致一致；加磷硫铁试剂必须与乙醇分成两层，；加磷硫铁试剂必须与乙醇分成两层，然后混合，不能边加边摇，否则显色不完然后混合，不能边加边摇，否则显色不完全；磷硫铁试剂要全；
