液相色谱质谱分析

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1、 液相色谱质谱分析液相色谱质谱分析一、一、 液相色谱概述液相色谱概述二、二、 HPLCHPLC仪器构成仪器构成三、高效液相色谱法的类型及分离机理三、高效液相色谱法的类型及分离机理四、色谱分离方法的选择四、色谱分离方法的选择五、质谱仪五、质谱仪主要内容主要内容一、一、 概概 述述 高效液相色谱高效液相色谱（HPLC）是一种以是一种以液体为流液体为流动相动相的的快速分离分析色谱技术快速分离分析色谱技术。具有。具有高压、高速、高压、高速、高效、高灵敏度高效、高灵敏度的特点，对于那些的特点，对于那些沸点高沸点高，热稳热稳定性差定性差，相对分子质量大相对分子质量大的的有机化合物有机化合物如烷烃、如烷烃、

2、烯烃、芳烃、染料、蛋白质、氨基酸、核酸等均烯烃、芳烃、染料、蛋白质、氨基酸、核酸等均可进行分离分析。可进行分离分析。 1 、高效液相色谱、高效液相色谱1）高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 10cm3min-1.2）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20。对于占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。高效液相色谱的优点高效液

3、相色谱的优点3）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 4）气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。高效液相色谱的优点高效液相色谱的优点2 、液相色谱仪器液相色谱仪器（high performance liquid chromatograph）液相色谱仪（液相色谱仪（1）液相色谱仪（液相色谱

4、仪（2）液相色谱仪（液相色谱仪（3）液相色谱仪（液相色谱仪（4）LCQ Deca XP MAX液相色谱质谱联用仪液相色谱质谱联用仪二、二、 HPLC仪器构成仪器构成1 、流程流程2 、 HPLC仪器组成：仪器组成： 高压输液装置高压输液装置 进样系统进样系统 分离系统分离系统 检测系统检测系统 高压输液系统 (1) 贮液器贮液器 用来供给足够数量的合乎要求的流动相以完成分析用来供给足够数量的合乎要求的流动相以完成分析工作。工作。材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮材质：玻璃、不锈钢、氟塑料或特种塑料聚醚醚酮（PEEK） 容积：容积：0.52.0L 放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压

5、差放置位置：高于泵体，保持一定的输液静压差 注意：密封、过滤注意：密封、过滤流动相过滤与脱气装置 流动相过滤装置 分为在线过滤和真空过滤 流动相脱气装置 分为在线真空脱气和超声波脱气泵体材料耐腐蚀泵体材料耐腐蚀泵腔的体积要小，泵腔的体积要小，以便快速更换以便快速更换溶剂溶剂能在高压下连续能在高压下连续工作工作, ,耐压耐压40-40-50MPa. cm50MPa. cm2 2压力平稳，无压力平稳，无脉冲脉冲高压输液泵高压输液泵输出流量稳定，输出流量稳定，重复性高重复性高, ,输出输出流量范围宽流量范围宽(2) 高压输液泵高压输液泵 梯度淋洗装置梯度淋洗装置 (内梯度)(外梯度)梯度淋洗装置梯度

6、淋洗装置等度洗脱与梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱的特点的特点改善分离改善分离, , 加快分析速度；加快分析速度；改善峰形改善峰形, , 减少拖尾减少拖尾; ;可能引起可能引起基线漂移基线漂移分配比变化范围宽的分配比变化范围宽的复杂样品应采取复杂样品应采取梯度洗脱方式分离梯度洗脱方式分离1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2) 适用于所选择的检测器。适用于所选择的检测器。3) 化学惰性好，以免破坏固定相。化学惰性好，以免破坏固定相。4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5) 纯度高。溶剂

7、不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。流动相溶剂选流动相溶剂选择的一般要求择的一般要求(2)(2) 进样系统进样系统进样针进样针六通阀六通阀 准备状态准备状态 进样状态进样状态六通阀进样六通阀进样 装置装置六通阀进样六通阀进样 装置的使用及保养装置的使用及保养1、进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品 溶液均要用045微米的滤膜过滤。 2、进样时，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，以免漏液和引 入空气；另外，也防止了针头刺坏密封组件及定子。 3、进样时，要求完全置换样品定量环内残留的溶液，以此提 高精密度及重现性。4、进样时，手柄处于Load和In

8、ject之间时，应尽快转阀，不 能停留在中途。5、每次结束后应反复冲洗进样器再用无纤维纸擦净注射器针 头的外侧。(3) 分离系统分离系统 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。色谱柱色谱柱1使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有 一定的溶解度)。2大多数反相色谱柱的pH稳定范围是27.5，尽量不超过该色谱 柱的pH范围。3避免流动相组成及极性的剧烈变化。4流动相使用前必须经脱气和过滤处理。5如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱 子冲洗干

9、净，并保存大乙腈中。6压力升高是需要更换预柱的信号。色谱柱的使用和维护色谱柱的使用和维护(4) 液相色谱检测器液相色谱检测器a. 紫外检测器紫外检测器b. 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器c.示差折光检测器示差折光检测器d. 荧光检测器荧光检测器e.电导检测器电导检测器f. 质谱检测器质谱检测器a. 紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机应用最广，对大部分有机化合物有响应。化合物有响应。特点：特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。b. 光电二极管阵列检测器光电二

10、极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。两种检测器的色谱图两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器：二极管阵列检测器nm254 紫外检测器紫外检测器灵敏度高，灵敏度高，精密度及线性范围较好精密度及线性范围较好 ，可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。 流动相选择有限制。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂溶剂CS2氯仿氯仿 四氢四氢呋喃呋喃苯苯乙腈乙腈甲醇甲醇水水紫外截

11、紫外截止波长止波长/nm380245212210 190205187类类 型型 主要分离机理主要分离机理 主要分析对象或应用领域主要分析对象或应用领域 吸附色谱吸附色谱 吸附能，氢键吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备异构体分离、族分离，制备分配色谱分配色谱 疏水分配作用疏水分配作用 各种有机化合物的分离、分析与制备各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱凝胶色谱 溶质分子大小溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布的测定高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱离子交换色谱 库仑力库仑力 无机离子、有机离子分析无机离子、有机离子分析离子排斥色谱离子排斥色谱 Donnan膜平衡膜平衡 有机