基因表达的定量检测分析

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1、基因表达的定量检测分析 基因表达的定量检测方法1. 蛋白表达水平的检测： 1）定量检测分析： western blotting、ELISA、HPLC 2）蛋白质功能分析： 蛋白质亚细胞定位分析：免疫荧光技术 蛋白相互作用研究：酵母双杂交、免疫共沉淀（IP）、 荧光共振能量转移（FRET） 酶活性检测：ELISA、HPLC2. mRNA表达水平检测： 1）半定量RT-PCR 2）Northern blot 3）实时荧光定量PCR（Realtime PCR） Northern blot 杂交 是用来检测真核生物RNA的表达量和大小，以估计其丰度的实验方法，可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其

2、基本步骤包括： 1. 完整mRNA的分离 2. 根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离 3. 将RNA 转移到固相支持物（尼龙膜）上，在转移的过程中， 要保持RNA 在凝胶中的相对分布 4. 将RNA固定到支持物上（UV交联） 5. 固相RNA与探针分子（DNA或RNA）杂交 6. 除去非特异结合到固相支持物上的探针分子 7. 对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析Realtime PCR 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR

3、污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线或内参基因的关系对起始模板进行定量分析的方法。 与常规PCR技术比较：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段： 荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。 在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。 而在平台期，扩增产物已不再呈