第十章 PCR技术

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1、第十章第十章 核酸扩增技术核酸扩增技术生物样品生物样品但是，目的基因在样品中含量很低但是，目的基因在样品中含量很低如果我们能这样就好了如果我们能这样就好了 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因。 但由于测序和引物合成的困难，Khorana的设想被人们遗忘了DNA变性、复性（退火） 退火退火不同来源的核酸经不同来源的核酸经变性变性和和复性复性的过程，其中一的过程，其中一些些局部碱基互补片段局部碱基互补片段在复性时在复性时形成杂化双链形成杂化双链的过程。的过程。加热加热核酸分子杂交DNA半保留复制体内DNA的生物合成很

2、少有在公司工作的科研人员获得很少有在公司工作的科研人员获得诺贝尔，诺贝尔，Mullis是其中之一是其中之一美国美国CetusCetus公司的公司的（1944-1944-），原本是要），原本是要合成合成DNADNA引物来进行测序工引物来进行测序工作，却常为没有足够的模板作，却常为没有足够的模板DNADNA而烦恼。而烦恼。19831983年春夏之交的一个晚上，年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌他开车去乡下别墅的路上萌发了用发了用两个两个引物（引物（而不是一而不是一个引物个引物）去扩增模板）去扩增模板DNADNA的的想法想法Mullis的方法55退火退火94变性变性引物引物引物引物37加

3、入加入DNA聚合酶聚合酶引物引物引物引物第一轮循环第一轮循环第二轮循环第二轮循环第三轮循环第三轮循环945537大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶由于大肠杆菌由于大肠杆菌DNADNA聚合酶不耐热，每个循环都要加酶聚合酶不耐热，每个循环都要加酶()40 50 60 70 80 90100 80 60 40 20钱嘉韵（ 1973 年）由于由于Taq DNATaq DNA聚合酶耐热，一次加酶可进行多个循环聚合酶耐热，一次加酶可进行多个循环 一种能在体外特异地扩增特定核酸片段一种能在体外特异地扩增特定核酸片段的技术，可以在几个小时内将极微量的的技术，可以在几个小时内将极微量的目的基因扩增成千上

4、万倍。目的基因扩增成千上万倍。 聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction加热使双螺旋的模板DNA分开，形成单链DNA 。降低温度，引物和DNA模板的互补区域形成局部杂交。 在模板链的指导下，DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸（dNTP）沿53方向加到引物上，形成新的DNA链。4、以上三个步骤的循环。变性变性延伸延伸退火退火949850657075PCRPCR三步曲三步曲n变性变性 94949898n退火退火 50506565n延伸延伸 707075751234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高

5、温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA94PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理P

6、CR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束第2轮变性、退火延伸第3轮变性、退火延伸PCRPCR理论扩增效率理论扩增效率循环 初始模板扩增倍数 目的DNA扩增倍数120240362488510221020100420401048536306010737417642n-2nPCR的特点特异性强：PCR扩增的特异性取决于引扩增的特异性取决于引物与模板物与模板DNA的特异性结合的特异性结合灵敏度高n 皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量级扩增到微克量级扩增到微克( (ugug=10=10-6-6) )水平水平n 能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞n

7、病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFURFUn 细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌简便快捷：一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 24 4 小小时完成扩增时完成扩增1. 对样本要求低：血液、体腔液、洗嗽液、血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等；毛发、细胞、活组织等；DNA/RNADNA/RNA；纯品；纯品/ /粗品粗品DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）引物引物原料（原料（dNTPdNTP）模板（模板（DNADNA分子分子) )BufferBuffer（Mg2+Mg2+）缓冲液缓冲液（酶促剂酶促剂）PCR体系组成体系组成:总体积

8、总体积20-100 l （不足用（不足用ddH2O)引物引物dNTP 模板模板DNABuffer（Mg2+）（Thermus aquaticus)价格适宜，延伸速度价格适宜，延伸速度1kb/min，无校正功能；具有类似末端转移酶的活性，末端加无校正功能；具有类似末端转移酶的活性，末端加A； 使用浓度：使用浓度：（酶量过多，反应特异性下（酶量过多，反应特异性下降；酶量过少影响反应产量）。降；酶量过少影响反应产量）。有很强的校正功能，延伸速度有很强的校正功能，延伸速度500bp/min，价格昂贵。，价格昂贵。普通普通rTaq和和Pfu DNA聚合酶的混合物聚合酶的混合物 （1 1）引物长度：）引物

9、长度：为宜。为宜。（2 2）引物组成：）引物组成：引物对碱基组成一致。引物对碱基组成一致。（3 3）引物结构：）引物结构：碱基尽可能随机分布；内部、两引物间避碱基尽可能随机分布；内部、两引物间避免有互补序列；引物免有互补序列；引物3 3端为关键，必需与模板碱基配对端为关键，必需与模板碱基配对（最好是（最好是G/CG/C）；）；5 5端无严格限制，可以修饰。端无严格限制，可以修饰。（4)4)引物特异性：引物特异性：与目的基因特异配对，与非扩增区无同源与目的基因特异配对，与非扩增区无同源性。性。引物浓度：引物浓度： ，以最低引物量产生所需要的结果为好；，以最低引物量产生所需要的结果为好； 浓度过高

10、易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配, ,反应特异性下降。反应特异性下降。l浓度：取决于扩增片段的长度浓度：取决于扩增片段的长度（浓度过高易产生碱基错配，浓度过（浓度过高易产生碱基错配，浓度过低则降低反应产量；四种低则降低反应产量；四种dNTP浓度应相等，任何一种偏高浓度应相等，任何一种偏高或偏低，也会引起错配）或偏低，也会引起错配） l dNTP溶液小量分装，置溶液小量分装，置-20冰冻保存，减少冻融次数冰冻保存，减少冻融次数纯度要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、纯度要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚聚合酶抑制剂、合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。结合蛋白类。一般一般50

11、-100ng DNA模板模板/100 L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。调节调节pH 促进引物退火促进引物退火稳定酶活性稳定酶活性促进引物与模板配对，促进引物与模板配对， 特异产物增加，灵敏度增加特异产物增加，灵敏度增加 可影响酶活性、解链温度、退火温度、扩增效率、可影响酶活性、解链温度、退火温度、扩增效率、扩增特异性和引物二聚体的形成等。扩增特异性和引物二聚体的形成等。 Taq酶活性需要酶活性需要Mg2+ ，Mg2+浓度过高导致非特异浓度过高导致非特异扩增。在一般的扩增。在一般的PCR反应中，各种反应中，各种dNTP浓度为浓度为200 mol/L