生化技术：3吸附层析

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1、 第三章第三章 吸吸 附附 层层 析析 层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨维特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分维特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分离纯化方法。其总的原理是离纯化方法。其总的原理是根据各种被分离组分根据各种被分离组分在固定相和流动相的在固定相和流动相的分配系数分配系数不同不同达到分离的目达到分离的目的的 层析法根据其层析类型，可分为柱层析、纸层析法根据其层析类型，可分为柱层析、纸层析和薄层层析；根据具体分离原理分，可分为层析和薄层层析；根据具体分离原理分，可分为吸附层析、分配层析、疏水层析、离子交换层析、吸附层析、分配层析、疏

2、水层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等具体层析方法亲和层析、凝胶过滤层析等具体层析方法 吸附层析（吸附层析（absorption chromatography）又称色层法又称色层法或色谱法；是根据各种被分离组分在固定相和流动相的或色谱法；是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数分配系数不同达到分离的目的一类分离纯化方法不同达到分离的目的一类分离纯化方法吸附层析的概念吸附层析的概念 目目 的的掌握掌握吸附柱层析、薄层层析及聚酰胺薄层层析的基本原理和操作方法吸附柱层析、薄层层析及聚酰胺薄层层析的基本原理和操作方法 层层 析析 方方 法法 的的 类类 型型 第一节第一节 吸吸 附附 柱

3、柱 层层 析析 吸附柱层析是以吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相固体吸附剂为固定相制备成色谱制备成色谱柱，以柱，以有机溶剂或缓冲液为流动相有机溶剂或缓冲液为流动相，用于分离纯化的，用于分离纯化的一种层析方法一种层析方法 吸附柱层析的概念吸附柱层析的概念吸附层析吸附层析的固定相的固定相极性极性:如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等非极性：如活性碳等非极性：如活性碳等流动相通常为有机溶剂或缓冲液流动相通常为有机溶剂或缓冲液一、常一、常 用用 术术 语语 1固定相固定相 固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质(如

4、吸如吸附剂、离子交换剂附剂、离子交换剂)和液体物质和液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的如固定在纤维素或硅胶上的溶液溶液)，这些物质，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用解和交换作用2流动相流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。在柱层析中又称为洗脱剂或洗涤剂；在薄层层体或气体。在柱层析中又称为洗脱剂或洗涤剂；在薄层层析中又称为展开剂析中又称为展开剂3层析层析 以基质为固定相以基质为固定相(柱状或薄层状柱状或薄层状)，以液体或气体为流动，以液体或气体为流动相，使有效成

5、分和杂质在这相，使有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行两个相中连续多次地进行分分配、吸附或交换配、吸附或交换，最终使混合物得到分离，最终使混合物得到分离的过程的过程4操作容量操作容量 是反映基质（固定相）对某种成分的结合能力的指标是反映基质（固定相）对某种成分的结合能力的指标；它表示在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡；它表示在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克(或毫升或毫升)基基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。其数值大其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；

6、否则反之，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之5床体积床体积(Vt) 是指膨胀后的基质在层析柱中所是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积占有的体积(Vt)。它是基质的外水体积它是基质的外水体积(Vo)和内水体积和内水体积(Vi)以及自身体积以及自身体积(Vg)的的总和，详见图总和，详见图3-1，即，即V=Vo+Vi+Vg6洗脱体积洗脱体积(Ve) 是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相到最大值时的流动相体积。用体积。用Ve 表示表示(见图见图3-7中中OB) 7外水体积外水体积(Vo) 外水体积指基质颗粒之间体积的总和外

7、水体积指基质颗粒之间体积的总和 8内水体积内水体积(Vi) 内水体积是指基质颗粒内部体积的总和内水体积是指基质颗粒内部体积的总和 9基质体积基质体积(Vg) 基质体积是指基质自身所具有的体积。基质体积是指基质自身所具有的体积。 Vo、Vi和和Vg都是随着床体积和基质性质变化而变都是随着床体积和基质性质变化而变化的化的10膨胀度膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积（用（用V表示）。即每克溶胀基质所具有的床体积表示）。即每克溶胀基质所具有的床体积 一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大11分配系数

8、分配系数 是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示表示12.迁移率迁移率 指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值。常用动距离之比值。常用Rf表示表示 二、基本原理二、基本原理 利用被分离样品中不同组分与吸附剂之间利用被分离样品中不同组分与吸附剂之间吸附能力吸附能力的差异的差异（或各组分的分配系数不同）进行分离。吸附能力大（或分（或各组分的分配系数不同）进行分离。吸附能力大（或分配系数大）的组分在柱子上的保留时间长，吸附能力小（或配系数大）的组分在柱子上的保留时间长，吸

9、附能力小（或分配系数小）的组分很快被洗脱分配系数小）的组分很快被洗脱 混合物在层析柱中分离的过程实质上是吸附与解吸附的混合物在层析柱中分离的过程实质上是吸附与解吸附的过程过程三、吸三、吸 附附 剂剂 （一）吸附剂的选择（一）吸附剂的选择1.具备条件：具备条件：表面积大、吸附选择性好、稳定性强、成本表面积大、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉等低廉等2.选择原则：选择原则：由吸附剂本身和被吸附物质的理化性质而定。由吸附剂本身和被吸附物质的理化性质而定。根据根据“相似相溶相似相溶”原理，为了便于解吸附（洗脱），对于原理，为了便于解吸附（洗脱），对于极性强的分离物，应选择极性小的吸附剂；而对于极性弱极

10、性强的分离物，应选择极性小的吸附剂；而对于极性弱的分离物则选择极性强的吸附剂的分离物则选择极性强的吸附剂（二）吸附剂的性质（二）吸附剂的性质2020世纪世纪5050年代初期，年代初期，TiseliusTiselius等用制备的羟基磷等用制备的羟基磷灰石灰石 CaCa5 5(P0(P04 4) )3 3OHOH2 2（HAHA）分离蛋白质。目前国内）分离蛋白质。目前国内已有商品出售已有商品出售 1.羟基磷灰石羟基磷灰石 （1）性质）性质 吸附容量高吸附容量高稳定性好（稳定性好（T85，pH5.510.0均可使用）均可使用）使用广泛（可用于制备和纯化使用广泛（可用于制备和纯化pro、酶、核酸等）、