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1、第第4章章 RNA的生物合成的生物合成(Biosynthesis of RNA)基因的表达（Gene expression）之mRNA:提供了代表蛋白质的提供了代表蛋白质的DNA序列的信息序列的信息传递中间体传递中间体生物体以生物体以DNADNA为模板合成为模板合成RNARNA的过程。的过程。 转录转录RNARNADNADNA 转录转录 (transcription)三种三种RNA信使信使RNA(mRNA)转运转运RNA(tRNA)核糖体核糖体RNA(rRNA)1. 都是酶促的核苷酸聚合过程都是酶促的核苷酸聚合过程2. 都以都以DNA为模板为模板3. 都需依赖都需依赖DNA的聚合酶的聚合酶4.
2、 聚合过程都核苷酸之间生成磷酸二酯键聚合过程都核苷酸之间生成磷酸二酯键5. 都是都是53方向延伸核苷酸链方向延伸核苷酸链6. 都遵从碱基配对规律都遵从碱基配对规律转录与复制的相似点转录与复制的相似点 转录和复制的区别转录和复制的区别复制复制转录转录模板模板DNA双双链链DNA的的一条一条链链原料原料dNTP (N=A、G、C、T)NTP(N=A、G、C、U)引物引物需要需要不不需要需要酶酶DNA聚合酶聚合酶RNA聚合酶聚合酶产物产物DNARNA配对配对A-T、G-CA-U、T-A、G-C参与转录的物质参与转录的物质模板模板: DNA原料原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP)
3、酶酶: 依赖依赖 DNA 的的 RNA 聚合酶聚合酶 (RNA polymerase, RNA-pol)其他蛋白质因子和离子其他蛋白质因子和离子4.1 基本概念基本概念4.2 原核生物的转录过程原核生物的转录过程4.3 真核生物的转录过程真核生物的转录过程4.4 转录产物的加工转录产物的加工 4.1 基本概念基本概念 转录转录 转录是遗传信息由转录是遗传信息由DNA转换到转换到RNA的过程。的过程。作为作为蛋白质生物合成蛋白质生物合成的第一步，转录是的第一步，转录是mRNA以及非编码以及非编码RNA（tRNA、rRNA等）的等）的合成步骤。合成步骤。 以双链以双链DNA中的一条链为模板，以腺三
4、中的一条链为模板，以腺三 转转录磷（录磷（ATP）、胞三磷（）、胞三磷（CTP）、鸟三磷）、鸟三磷（GTP）和尿三磷（）和尿三磷（UTP）4种核苷三磷酸种核苷三磷酸为原料，在为原料，在RNA聚合酶催化下合成聚合酶催化下合成RNA的的过程。过程。 基因表达的第一步 以D. S. DNA中的一条单链作为转录的模板 在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下 按AU、CG配对的原则，合成RNA分子 模板单链DNA的极性方向为3 5, 而非模板单链DNA的极性方向与RNA链相同，均为5 3。 非模板链非模板链 又称编码链、有义链或正（+）链:指不作模板的DNA单链模板链模板链 又称反编码链、反义链、无义链或负
5、（-）链 :指作为模板进行RNA转录的链 RNA的转录包括的转录包括promotion, elongation, termination 三过程三过程从启动子（从启动子（promoter）到终止子（）到终止子（terminator）称为转录单位（称为转录单位（transcriptional unit）某一基因只以一条单链某一基因只以一条单链DNA 为模板进行转录为模板进行转录（不对称转录）（不对称转录）不对称不对称转录转录(asymmetric transcription) DNA分子的双链均有转录功能,但对于一个特定的DNA区域或对一个特定的mRNA,只能有一条链为模板进行转录，这种现象叫转
6、录的不对称性,即在在DNA分子双链上某一区段分子双链上某一区段,一股链用作模板一股链用作模板指引转录，另一股链不转录指引转录，另一股链不转录 RNA合成过程，天然双链DNA为不对称转录，但体外条件下，一般DNA的2条链都可以作为模板链转录RNA，称为对称转录对称转录 5335模板链模板链编码链编码链（coding strandcoding strand）结构基因结构基因（ structural genestructural gene ）编码链编码链模板链模板链（template strandtemplate strand） DNA分子双链上某一区段，一条链可转录，另一分子双链上某一区段，一条链
7、可转录，另一条链不转录，但模板链并非永远在同一单链上。条链不转录，但模板链并非永远在同一单链上。原核生物中的转录单位多为多顺反子（polycistron in operon）真核生物中的转录单位多为单顺反子（monocistron, No operon）Prokaryotic mRNA (polycistrionic)Eukaryotic mRNA (monocistrionic)EXCEPTION: C. elegance have 15% of its genes grouped in operons; but pre-mRNA processed into separate mRNA b
8、efore translation. 转录起点即转录原点记为1，其上游记为负值，下游记为正值 4.2 原核生物的转录过程原核生物的转录过程(The process of transcription)4.2.1 原核生物启动子原核生物启动子 启动子启动子：是指：是指DNA分子上被分子上被RNA聚合酶识别聚合酶识别 并结合形成起始转录复合物的区域并结合形成起始转录复合物的区域 ，它还，它还包括一些调节蛋白因子的结合位点包括一些调节蛋白因子的结合位点 是控制转录起始的序列，决定基因转录的是控制转录起始的序列，决定基因转录的起始位点和表达强度等。起始位点和表达强度等。(频率、效率频率、效率) 4.2.
9、1.1 原核启动子的发现和证实原核启动子的发现和证实乳糖操纵子乳糖操纵子(lac operon)的结构的结构 调控区调控区 结构基因结构基因Z： -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y： 透酶透酶A：乙酰基转移酶：乙酰基转移酶调控基因调控基因启动序列启动序列操纵序列操纵序列IDNAZYAOPFootprinting(足迹足迹) technique验证核心启动子验证核心启动子+RNA聚合酶（没有NTP)DNase 消化分离测序1975, David Pribnow& Heinz Schaller-35 site，RNA聚合酶识别位点，聚合酶识别位点，R Site，RNA聚合酶松弛结合位点保聚合酶松弛结
10、合位点保守序列守序列TTGAC-10 site，RNA聚合酶结合位点，聚合酶结合位点，B Site，RNA聚合酶紧密结合位点保聚合酶紧密结合位点保守序列守序列TATAAT+1 site，RNA聚合酶转录起始位点，聚合酶转录起始位点，I Site，保守序列，保守序列A/G.Sextama box核心启动子（核心启动子（Core Promoter）原核启动子的其他组成部分和功能原核启动子的其他组成部分和功能UP element: CAP-cAMP 结合位点结合位点 基因表达调控的正调控位点基因表达调控的正调控位点扩展的启动子扩展的启动子4.2.1.2 原核生物启动子的突变效应原核生物启动子的突变效
11、应 强启动子和弱启动子：强启动子和弱启动子：区别在于和启动子序列与标准启动子序列同源性程度的大小。 上调突变与下调突变：上调突变与下调突变：如突变后序列偏离标准序列，启动子效率下降，为下降突变，反之突变后启动子序列更接近标准序列，启动子效率增强，为上升突变。 下调突变通常是A:T碱基对突变为G:C碱基对，使稳定性增强；也有A:T变为T:A，改变碱基堆积力，或改变RNA聚合酶的结合能力。 大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶聚合酶亚亚 36512 决定哪些基因被转录决定哪些基因被转录 150618 与转录全过程有关（催化）与转录全过程有关（催化） 155613 结合结合DNA模板（开链）模板（开链） 7
12、0263 辨认起始点辨认起始点基基分分 子子 量量功功 能能2 1 1 1 数目数目4.2.2 原核生物原核生物RNA聚合酶聚合酶全酶全酶 (holoenzyme) 2 转录延长转录延长 转录起始转录起始核心酶核心酶 (core enzyme) 2 亚基与转录过程中转录泡的解链和双链的亚基与转录过程中转录泡的解链和双链的再结合有关，并且和再结合有关，并且和cAMP-CAP因子结合，因子结合，发动转录。发动转录。亚基可能参与全酶和启动子的牢固结合参与全酶和启动子的牢固结合.这一牢固结合需要DNA双螺旋的局部解链;当RNA聚合酶核心酶沿着模板移动、进行RNA链的延伸时,需要不断地在前面解开双螺旋,
13、在后面恢复双螺旋,这些作用可能与两个亚基的功能有关 各亚基的功能各亚基的功能亚基参与底物的结合（包括前体核苷三磷亚基参与底物的结合（包括前体核苷三磷酸以及已经形成的酸以及已经形成的RNA链），催化磷酸二链），催化磷酸二酯的形成酯的形成 亚基两功能位点：起始位点亚基两功能位点：起始位点(Rifs),专一结合专一结合ATP,GTP; 延伸位点延伸位点(RifR),无无NTP专一性，保证延专一性，保证延伸。伸。 各亚基的功能各亚基的功能亚基为结合非模板链亚基。亚基为结合非模板链亚基。在离体转录试验中，肝素(heparin)能抑制转录作用，人们发现肝素是与亚基紧密结合的。亚基是碱性最强的亚基，而肝素是
14、一种酸性的粘多糖，正好与核酸竞争亚基，从而妨碍亚基与反义链的结合。各亚基的功能各亚基的功能亚基的最主要功能是识别启动子，亚基的最主要功能是识别启动子，细胞内细胞内DNA双链的哪条链被转录，双链的哪条链被转录，即转录的方向、转录起点的选择都即转录的方向、转录起点的选择都与与亚基有关亚基有关 各亚基的功能各亚基的功能不同的不同的亚基识别不同类型的启动子，亚基识别不同类型的启动子，可借以调节基因转录，而核心酶相可借以调节基因转录，而核心酶相同，即哪条链被转录，起始点在什同，即哪条链被转录，起始点在什么地方靠么地方靠亚基识别，与核心酶无关亚基识别，与核心酶无关 各亚基的功能各亚基的功能7070是大肠杆
15、菌细胞中最丰富的一类是大肠杆菌细胞中最丰富的一类因因子，参与大肠杆菌大多数基因的转录。子，参与大肠杆菌大多数基因的转录。在不同细菌细胞中，在不同细菌细胞中，的种类变化很大，的种类变化很大，从只有一种到从只有一种到6060几种。几种。生活方式多变的物种体内生活方式多变的物种体内的种类多。的种类多。大肠杆菌利用不同的大肠杆菌利用不同的适应环境的变化。适应环境的变化。和真核细胞中的基因特异转录因子的功和真核细胞中的基因特异转录因子的功能有些类似。能有些类似。RNA聚聚合合酶酶结结构构模模型型RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合聚合酶全酶在转录起始区的结合 核心酶的核心酶的四个四个功能位点：非模板链结合
16、位功能位点：非模板链结合位点（点（ ）；模板链结合位点（）；模板链结合位点（ ）；双链）；双链DNA解旋位点（解旋位点（ unwinding point） ；双；双链链DNA重绕位点（重绕位点（ rewinding point ） 从从DNADNA分子中分子中识别转录的起始部位识别转录的起始部位； 促使与酶结合的促使与酶结合的DNADNA双链分子打开双链分子打开； 催化聚合催化聚合的核苷酸以的核苷酸以3 3 ,5 ,5 - -磷酸二酯键磷酸二酯键相连接，从而连续沿相连接，从而连续沿5 5 -3 -3 方向进行聚合方向进行聚合反应、完成一条反应、完成一条RNARNA链的合成；链的合成； 识别识别
17、DNADNA分子中的分子中的转录终止信号转录终止信号，使聚合酶，使聚合酶反应在模板适当位置停止。反应在模板适当位置停止。RNA pol 具有多种功能具有多种功能 转录时的聚合反应速率为转录时的聚合反应速率为3085核苷酸核苷酸/秒秒(nt/s)，比比DNA复制的聚合反应速率慢；复制的聚合反应速率慢； RNA聚合酶缺乏聚合酶缺乏3 5 外切酶活性，所有它外切酶活性，所有它没没有校对功能有校对功能。RNA合成的错误约为合成的错误约为10-4 10-5，较较DNA合成的错误率高很多。合成的错误率高很多。 原核生物的原核生物的RNA聚合酶都受一类抗结核药聚合酶都受一类抗结核药利福利福平平和和利福霉素利
18、福霉素的特异性抑制。这类药物能与的特异性抑制。这类药物能与RNA聚合酶的聚合酶的 亚基亚基特异结合，从而影响酶的特异结合，从而影响酶的活性。活性。 4.2.3 转录过程转录过程The process of transcription转录起始（转录起始（initiation）转录延长（转录延长（elongation）转录终止（转录终止（termination）原核生物转录过程分为三个阶段原核生物转录过程分为三个阶段4.2.3.1 转录起始转录起始（The promotion of Transcription）转录起始转录起始转录起始是RNA聚合酶与DNA转录启动子结合形成有功能的转录起始复合物的
19、过程。是决定转录活性和RNA合成效率的关键步骤。是转录过程的限速步骤，是基因表达的首要和关键阶段。转录起始需解决两个问题转录起始需解决两个问题 RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。的起始区域。1.DNA双链解开，使其中的一条链作为转双链解开，使其中的一条链作为转录的模板，合成第一个磷酸二酯键录的模板，合成第一个磷酸二酯键RNApol ( 2 ) - DNA - pppGpN- OH 3 RNA 聚合酶全酶聚合酶全酶( 2)识别并结合到识别并结合到DNA模板上的启动子上，形成模板上的启动子上，形成 闭合转录复合体。闭合转录复合体。 DNA 双链局部解开，
20、形成开放转录复合体。双链局部解开，形成开放转录复合体。 在在 RNA 聚合酶作用下发生第一次聚合反应，聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成形成转录起始复合物。转录起始复合物。转录起始过程转录起始过程 RNApol ( 2) - DNA - pppGpN- OH 3 转录起始复合物转录起始复合物RNA pol催化形成催化形成610个磷酸二酯键后，个磷酸二酯键后， 亚亚基即从转录起始复合物上脱落，核心酶继续基即从转录起始复合物上脱落，核心酶继续结合于结合于DNA模板上，酶沿模板上，酶沿DNA链前移，进入链前移，进入延长阶段。延长阶段。转录的起始过程转录的起始过程核心酶核心酶1217bp（亚基）亚基
21、）4.2.3.2 延长阶段延长阶段1. 亚基脱落，亚基脱落，RNApol 聚合酶核心酶变构，与模聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着板结合松弛，沿着DNA模板前移。模板前移。2.在在核心酶核心酶作用下作用下,NTP不断聚合不断聚合,RNA链不断延长。链不断延长。3.以以转录复合物转录复合物的形式进行。的形式进行。 在转录延长过程中，由局部打开的在转录延长过程中，由局部打开的DNA双链、双链、RNA聚合酶的核心酶及新生成的聚合酶的核心酶及新生成的RNA三者结合三者结合在一起的复合体。在一起的复合体。该复合体为空泡状结构该复合体为空泡状结构,故形故形象地称为象地称为转录泡转录泡 (transcr
22、iption bubble)。转录空泡转录空泡(transcription bubble)：RNA-pol （核心酶）核心酶） DNA RNAElongation1. From initiation to elongation, RNAP have a significant conformation change.2. RNAP cover 30bp DNA including transcription bubble.3. RNAP catalytic site have substrate-binding site and product binding site.4. Transcri
23、ption direction: 53.电镜下原核生物电镜下原核生物转录现象。转录现象。转录未完成，翻转录未完成，翻译已开始进行。译已开始进行。原核生物转录过程中原核生物转录过程中的羽毛状现象说明的羽毛状现象说明:5 3 DNA核糖体核糖体RNARNA聚合酶聚合酶在同一在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行；模板上，有多个转录同时在进行；转录尚未完成转录尚未完成,翻译已在进行。翻译已在进行。从转录起始到延伸的结构变化从转录起始到延伸的结构变化1. RNA的的5端脱离模板链端脱离模板链2. RNAP 释放释放 因子因子3. Nus-A蛋白和蛋白和RNAP 结合，形成复合物，进行链的结合，形成复
24、合物，进行链的延伸延伸转录泡：转录位点转录泡：转录位点13个碱基对的解链区域，个碱基对的解链区域，一个动态、短暂的解链结构。一个动态、短暂的解链结构。转录过程需要拓扑异构酶转录过程需要拓扑异构酶和和。新生新生RNARNA链与模板链形成只有几个碱基的杂交链与模板链形成只有几个碱基的杂交双链。双链。延伸的暂停和阻滞延伸的暂停和阻滞暂停暂停 若在转录过程中，转录产物形成特定的二级结构，如发夹结构，或NTP暂时短缺，均有可能造成转录暂停。倒退倒退 转录过程中发生了错误，RNA pol即向后滑动，新生3-OH端被暴露出来，错误的寡聚核苷酸被内源GreA或GreB蛋白切除。阻滞阻滞 若暂停的RNA pol
25、倒退，使RNA堵塞了有关的通道，转录就会完全阻滞。这时同样需要GreA或GreB切除突出的RNA，解除RNA pol前进的障碍。 指指RNA聚合酶在聚合酶在DNA模板上停顿下来不再模板上停顿下来不再前进，转录产物前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落链从转录复合物上脱落下来。下来。 分类：分类： 1. 依赖依赖 Rho ( )因子的转录终止因子的转录终止 2. 非依赖非依赖 Rho 因子的转录终止因子的转录终止 4.2.3.3 终止阶段终止阶段 用用T4噬菌体噬菌体DNA在试管内进行转录实验，转在试管内进行转录实验，转录产物比在细胞内转录出的要长。说明：录产物比在细胞内转录出的要长。说明：1
26、. 依赖依赖 因子的转录终止因子的转录终止转录终止信号是可以跨越的；转录终止信号是可以跨越的；细胞内某些因素有执行转录终止的功能。细胞内某些因素有执行转录终止的功能。 据此，据此，19691969年年, , J. Roberts 发现了能控制转录终发现了能控制转录终止的蛋白质，定名为止的蛋白质，定名为 因子因子。 因子是个由相同亚基组成的六聚体；因子是个由相同亚基组成的六聚体； 因子能结合因子能结合 RNA，与与 poly C 的结合力最强；的结合力最强； 因子还有因子还有 ATP 酶和解螺旋酶酶和解螺旋酶的活性。的活性。推论：推论：转录终止信号存在于转录终止信号存在于 RNA而非而非DNA模
27、板。模板。 因子终止转录的作用机制：因子终止转录的作用机制： 与与RNA转录产物结合，结合后转录产物结合，结合后 因子和因子和RNA聚合酶都可能发生构象变化，从而使聚合酶都可能发生构象变化，从而使RNA聚聚合酶停顿，解螺旋酶的活性使合酶停顿，解螺旋酶的活性使DNA/RNA杂化杂化双链拆离，利于产物从转录复合物中释放。双链拆离，利于产物从转录复合物中释放。 因子终止转录的作用过程因子终止转录的作用过程2. 非依赖非依赖 因子的转录终止因子的转录终止 DNA 模板上靠近终止处，有些特殊的碱基模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出序列，转录出 RNA 后，后，RNA 产物形成特产物形成特殊的结
28、构来终止转录。殊的结构来终止转录。 转录产物的转录产物的3末端常有多个连续的末端常有多个连续的U，连续，连续的的U区区5端上游的一级结构，接近终止区的端上游的一级结构，接近终止区的一段碱基可形成鼓槌状的茎环一段碱基可形成鼓槌状的茎环(stem-loop)/发夹发夹(hairpin)结构形式的二级结构，这是非结构形式的二级结构，这是非依赖依赖 因子的转录终止的普遍现象。因子的转录终止的普遍现象。5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUU
29、AGUCACCAGCCUUUUU. 3 RNA 5 TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3 DNA UUUU. UUUU.5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3接近终止区的一段碱基形成鼓槌状的茎环接近终止区的一段碱基形成鼓槌状的茎环(stem-loop)/发发夹夹(hairpin)结构形式的二级结构，是普遍现象。结构形式的二级结构，是普遍现象。茎环结构使转录终止的机理茎环结构使转录终止的机理 茎环结构在茎环结构在RNA分子形成分子形成
30、,可能改变可能改变RNA聚合酶构象，聚合酶构象，导致酶导致酶-模板结合方式改变模板结合方式改变,使酶停止向下游移动，于是使酶停止向下游移动，于是转录终止。转录终止。 DNA、RNA各自形成自身双链使杂化链不稳定各自形成自身双链使杂化链不稳定,转录转录复合物趋于解体，同时复合物趋于解体，同时 3端一连串端一连串U形成的形成的rU/dA配对配对最不稳定，易从模板上脱落，促进最不稳定，易从模板上脱落，促进RNA产物释放。产物释放。原核生物转原核生物转录终止信号录终止信号RNADNA转录起始转录起始 因子再利用因子再利用NusA取代取代 与与RNAP结合结合Rho蛋白促进转录终止蛋白促进转录终止转录复
31、合体解体转录复合体解体原核生物原核生物RNA转录和转录和DNA复制的区别复制的区别 （1 1）转录时只有一条）转录时只有一条DNADNA链为模板，而复制时两链为模板，而复制时两条条DNADNA链都可作为模板；链都可作为模板；（2 2）转录形成的）转录形成的DNA-RNADNA-RNA杂合双链不稳定，杂合双链不稳定，RNARNA合合成后释放，而成后释放，而DNADNA复制叉形成后一直打开；复制叉形成后一直打开；（3 3）RNARNA合成不需引物，而合成不需引物，而DNADNA复制需引物；复制需引物；（4) 4) 转录的底物是转录的底物是NTPNTP，复制的底物是，复制的底物是dNTPdNTP；（
32、5 5）聚合酶系不同，转录用）聚合酶系不同，转录用RNARNA聚合酶，而复制聚合酶，而复制用用DNADNA聚合酶；聚合酶；（6 6）转录产物是）转录产物是RNARNA，复制产物是，复制产物是DNADNA；（7 7）碱基和配对不同，转录是）碱基和配对不同，转录是A-UA-U、T-AT-A、G-CG-C，而复制是而复制是A-TA-T、G-CG-C。4.3 真核生物的转录过程真核生物的转录过程4.3.1 真核生物的真核生物的RNA聚合酶聚合酶4.3.2 真核生物启动子真核生物启动子4.3.3 4.3.3 真核生物转录的相关因子真核生物转录的相关因子4.3.4 真核生物的转录过程真核生物的转录过程4.
33、3.1 真核生物的真核生物的RNA聚合酶聚合酶 （1）真核生物的三种）真核生物的三种RNA pol： 根据对 - 鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类 RNApol 最不敏感 （动、植、昆） RNApol 最敏感 RNApol 不同种类的敏感性不同鹅膏蕈碱，一种毒菌类鬼笔鹅膏（Amanita phalloides）所生成的具有双环结构的八肽毒素。对动物的致死作用是：在真核细胞核内催化合成mRNA，这样合成的mRNA取决于DNA跟RNA聚合酶（或B）进行特异性结合，从而抑制磷酸二酯键的形成（RNA链合成的起始和延长）。在真核细胞RNA聚合酶的识别或RNA聚合酶的定量等方面是有用的。4.3.1 真核真核RN
34、A聚合酶聚合酶原核生物原核生物真核生物真核生物（2）位置和转录产物）位置和转录产物 RNApol 核仁核仁 活性所占比例最大活性所占比例最大 转录转录 rRNA（5.8S、18S、 28S） RNApol 核质核质 主要负责主要负责 hnRNA、snRNA RNApol 核质核质 负责负责 tRNA、5S rRNA、Alu序列和部分序列和部分 snRNA 目前在线粒体和叶绿体内发现少数目前在线粒体和叶绿体内发现少数 RNA pol（活性较低）（活性较低）（3）亚基组成：）亚基组成： 分子量分子量500KDa，均含，均含3个大亚基（个大亚基（RPB1、RPB2、RPB3）组成的）组成的核心亚基核
35、心亚基和和 712 个小亚基个小亚基 Bacterial RNAP Eukaryotic RNAP IIRPB1 RPB2I RPB3II RPB11wRPB6RNA pol II真核生物RNA聚合酶的结构模型RNA pol I和IIIRPB1，RPB2和RPB3是真核生物RNA聚合酶核心组成部分，其他的亚基为附属部分。RPB 5, 6,8,10和12在所有RNA聚合酶中通用，RPB 4和RPB9为不必要的部分。RNAP II 3-D 模型 RNAP III 3-D 模型 RNApol： 大亚基中有大亚基中有 C 末端结构域末端结构域 (CTD) CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复中含一保守
36、氨基酸序列的多个重复 TyrSerProThrSerProSer C 端重复七肽端重复七肽 不同生物中重复数目不一样（酶活性）不同生物中重复数目不一样（酶活性） RNApol： CTD中的 Ser和 Thr可被高度磷酸化 非磷酸化的 RNApol 被称为A 磷酸化的 RNApol 称为O CTD参与转录 A O 使 RNApol脱离起始复合物，启动子进入延伸过程（10倍） 蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。4.3.2 真核生物启动子真核生物启动子三种三种 RNApol 三种转
37、录方式三种转录方式 三种启动子三种启动子 三类基因，三类基因，类，类，类，类，类类4.3.2 真核生物启动子真核生物启动子顺式作用元件顺式作用元件(cis-acting element) 真核生物结构基因上游的调控区存在的真核生物结构基因上游的调控区存在的一致性一致性DNADNA序列，它包括启动子、启动子上序列，它包括启动子、启动子上游元件、增强子等。游元件、增强子等。真核启动子组成及功能真核启动子组成及功能核心启动子核心启动子近缘启动子元件近缘启动子元件远距离调控元件远距离调控元件通过改变“启动子”序列后对其转录能力的影响可确定启动子。在“启动子”上游加上相等长度的上游序列，在距离其下游约5
38、00bp处切断转录模板以保证聚合酶可从相同的位置脱离，产生可鉴别的转录物。从“启动子”两侧不断缩短长度直至丧生启动子功能。启动子功能的确定启动子功能的确定 （1） RNApol的启动子的启动子 结构最复杂 位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成 转录起始位点转录起始位点 PyPyANPuPy，Py是嘧啶，Pu是嘌呤，A为起点（+1） TATA框框（Hogness 框或 Goldberg-Hogness 框） 位于30处 一致序列为T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37） 定位转录起始点的功能 （类似原核的Pribnow框） TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的
39、 CAAT框（框（CAAT box） 位于75bp处 一致序列为GGC/TCAATCT 前两个 G 的作用十分重要(转录效率) 增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性 以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在 GC框框 （GC box） 位于90附近，较常见的成分 核心序列为GGGCGG 可有多个拷贝，也可以正反两方向排列 其他元件其他元件 八聚核苷酸元件（octamer element OCT元件） 一致序列为 ATTTGCAT 还有一些位于起始点下游的相关元件 不同元件的组合情况不同元件的组合情况 不同元件的数目、位置、和排列方向均有差异 例如：SV40的早期启动子中有6个GC框（2
40、）增强子）增强子 是能够结合特异基因调节蛋白，促进邻近或远是能够结合特异基因调节蛋白，促进邻近或远隔特定基因表达的隔特定基因表达的DNADNA序列。序列。（又称远上游序列 ) 在100以上 SV40的两个正向重复研究得最清楚 -107178 、179 250 各 72bp 该增强子的特点如下： 对依赖于TATA框的转录的增强效应高于不依赖的情况，可使旁侧的基因转录提高100倍。 细胞类型的选择：不同类型中作用有差异 表明其作用具有细胞或组织特异性（调节蛋白）（3）沉默子）沉默子(silencer) 最早在酵母中发现，以后在T淋巴细胞的T抗原受体基因的转录和重排中证实这种与增强子作用相反的负调控
41、顺式元件的存在。沉默子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。（4）绝缘子（）绝缘子（insulator） 绝缘子是能够阻断激活或失活效应的DNA元件。 绝缘子通过与特定蛋白的作用可阻断增强子对启动子的激活，也能够屏障异染色质延伸引起的基因失活效应。 它的作用具有方向性，不同于增强子，它屏蔽了增强子对不同启动子无选择性的顺式作用。转录起始点转录起始点TATA盒盒CAAT盒盒GC盒盒 增强子增强子顺式作用元件顺式作用元件(cis-acting element)AATAAA切离加尾切离加尾 转录终止点转录终止点 修饰点修饰点 外显子外显子 翻译起始点翻译起始点内
42、内含含子子 绝缘子绝缘子 真核生物启动子真核生物启动子 5 TATAAAA3 TATA box 5 G C C A A T 3 CAAT box 5 G G G C G G 3 GC box 5 A T T T G C A T 3 OCT-1小结小结不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交启动子功能没有变化各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，组成起始复合物，蛋白因子间的相互作用决定了转录的起始4.3.3 真核生物转录的相关因子真核生物转录的相关因子能直接、间接辨认和结合转录上游区段能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白的蛋白质，统称为质，
43、统称为反式作用因子反式作用因子(trans-acting factors)。 现已发现已发现数百种。现数百种。反式作用因子中，直接或间接结合反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，聚合酶的，则称为则称为转录因子转录因子(transcriptional factors, TF)。 真核生物真核生物 RNApol 需与转录因子结合后才结合模板。需与转录因子结合后才结合模板。 相应于相应于 RNA-pol、 的的 TF，分别称为分别称为 TF 、TF 、TF。 TF 又分为又分为 TFA、TFB等。等。 TFD 是唯一能结合是唯一能结合 TATA 盒的蛋白质。盒的蛋白质。参与参与RNA-pol
44、转录的转录的TF 蛋白激酶活性，使蛋白激酶活性，使CTD 磷磷酸化酸化TFHATPase57（ ） 34（ ）TFE解螺旋酶解螺旋酶30，74TFF促进促进RNA-pol结合及作结合及作为其他因子结合的桥梁为其他因子结合的桥梁33TFB稳定稳定D-DNA12，19，35TFATBP-DNA结合结合TAF*结合结合TATA盒盒TBP* 38TFD功功能能亚基组成或分子量亚基组成或分子量(kD)转录因子转录因子TFH57（ ） 34（ ）TFE30，74TFF33TFBTFD-DNA复合物复合物12，19，35TFA辅助辅助TAF*TBP* 38TFD功功能能()转录因子转录因子 与上游序列如与上
45、游序列如GC、CAAT等顺式元件结合的蛋白质。等顺式元件结合的蛋白质。上游因子上游因子可诱导因子可诱导因子 是与增强子等远端调控序列结合的转录因子。是与增强子等远端调控序列结合的转录因子。4.3.4 真核生物的转录过程真核生物的转录过程转录起始（转录起始（initiation）转录延长（转录延长（elongation）转录终止（转录终止（termination）真核生物转录过程也分为三个阶段真核生物转录过程也分为三个阶段以以RNA pol II为例为例4.3.4.1 转录起始转录起始 （initiation）TBP 使得结合区域的使得结合区域的DNA弯曲弯曲80度度RNA pol IITF I
46、I FTBP TAF TATADNATF II ATF II BTF II ETF II H转 录 前 起 始 复 合 物TBP: TATA Binding Protein、TAF: TBP Associated FactorCTD：Carboxyl Terminal Domain转录起始前复合物转录起始前复合物 (pre-initiation complex, PIC) 真核生物真核生物RNA-pol不与不与DNA分子直接结合，而需分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。组成依靠众多的转录因子。组成RNA-pol-转录因子转录因子-DNA复合物而启动转录。复合物而启动转录。 拼板理论拼板理论(
47、piecing theory) 人类基因约人类基因约2.54万个，为了保证转录的准确万个，为了保证转录的准确性，不同基因需要不同的转录因子，如何解释？性，不同基因需要不同的转录因子，如何解释？一个真核生物基因的转录需要一个真核生物基因的转录需要3至至5个转录因个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。地结合、转录相应的基因。就好比七巧板可拼出就好比七巧板可拼出许多不同类型的图案一样。许多不同类型的图案一样。 由于由于TF II H 具有AT
48、Pase、解旋酶和蛋白激酶活性，PIC形成以后，DNA很快被解链，使PIC由封闭状态转变为开放状态，并开始合成RNA。随后，RNA pol II的CTD在TFII H催化下被磷酸化。一旦RNA pol II的CTD被磷酸化，TF II D、TF II B和和TF II A等逐步从起始复合物解离下来。只有TBP和TF II F保留其上，形成延伸复合物。延伸复合物离开启动子，而TF II E，TF II H，TF II A，TF II D和调节物仍然在启动子上，随后脱离启子，参与另一次转录的起始，这一过程被称作启动子清空启动子清空。4.3.4.2 延伸延伸4.3.4.3 转录终止转录终止当转录进行
49、到3末端，遇到终止信号或终止子序列时，RNA pol II的CTD在TF II F的作用下去磷酸化，转录随即终止。RNA pol II/TF IIF 复合物离开模版，再与中介因子形成复合物，参与下一轮转录。可能与转录后修饰密切相关可能与转录后修饰密切相关5 -AAUAAA-5 -AAUAAA-核酸酶核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAA GTGTGTG转录终止的修饰点转录终止的修饰点5 5 3 3 3 3 加尾加尾AAAAAAA 3 mRNA14TAFsRate limiting stepTFH: Helicase and kinase原核生物与真核生物原核生物与真核生物RNARNA
50、转录的主要差别转录的主要差别 原核生物原核生物真核生物真核生物RNARNA聚合酶聚合酶 2 2 全酶、全酶、 2 2核心酶核心酶 亚基：决定哪些基因被转录亚基：决定哪些基因被转录 亚基：与转录全过程有关亚基：与转录全过程有关 亚亚基：结合基：结合DNADNA模板模板( (开链开链) ) 因子：辨认起始点因子：辨认起始点RNA pol IRNA pol I、RNA PolRNA Pol位于核仁位于核仁, ,合成合成rRNArRNA前体，前体，加工加工28SrRNA28SrRNA、5.8SrRNA5.8SrRNA、18SrRNA18SrRNA。RNA PolRNA Pol位于核质，合成位于核质，合
51、成hnRNAhnRNARNA Pol RNA Pol 位于核质，合成位于核质，合成tRNA5SrRNAtRNA5SrRNA和和snRNAsnRNA启动子启动子-35-35区区TTGACATTGACA是是RNA-polRNA-pol辨认位点辨认位点-10-10区区TATAATTATAAT是是RNA-polRNA-pol结合位点结合位点TATATATA结合结合TFIIDTFIID、CAATCAAT、GCGC结合上游结合上游因子因子, ,增强子结合可诱导因子增强子结合可诱导因子转录产物转录产物mRNAmRNA一般不需要加工。一般不需要加工。RNARNA转录后加工复杂，包括剪切、剪转录后加工复杂，包括
52、剪切、剪接、添加、修饰和编辑。接、添加、修饰和编辑。起始阶段起始阶段 因子辨认启动子起始点因子辨认启动子起始点RNARNA聚合酶全酶结合聚合酶全酶结合DNADNA模板模板转录因子与转录因子与DNADNA分子直接结合分子直接结合, ,不是不是RNA pol,RNA pol,组成组成RNA pol-RNA pol-转录因子转录因子-DNA-DNA转录前起始复合物转录前起始复合物(PIC)(PIC)延长阶段延长阶段RNARNA聚合酶核心酶聚合酶核心酶同一同一DNADNA模板上有多个转录同时模板上有多个转录同时进行进行, ,转录与翻译同步进行转录与翻译同步进行RNA pol IRNA pol I、核小
53、体移位和解聚现象核小体移位和解聚现象没有转录与翻译同步的现象没有转录与翻译同步的现象终止阶段终止阶段依赖依赖 Rho (Rho ( ) )因子的转录终止因子的转录终止非依赖非依赖 Rho Rho 因子的转录终止因子的转录终止与转录后修饰密切相关与转录后修饰密切相关转录终止的修饰点转录终止的修饰点AAUAAAAAUAAA GUGUGUG GUGUGUG4.4 转录产物的加工转录产物的加工 遗传信息在转录后要经过遗传信息在转录后要经过扩充和修饰，表现出扩充和修饰，表现出“非非忠实传递忠实传递”的特点。的特点。基因转录的直接产物即初级转录物(primary rtanscripts)通常是没有功能的，
54、必须经历转录后加工(posttranscriptional processing)才会转变为有活性的成熟RNA分子。转录产物的加工是基因表达的一个重要环节，对其进行深入研究，可以促进生命科学基础学科的发展，例如核酶就是在研究转录产物加工时发现的。此外，这一领域的研究，也有可能为生命科学在农业和医学领域的应用提供新途径，比如参与转录产物加工的小RNA，及其与蛋白质的复合物RNP如何影响某些基因的表达和细胞的功能，有无可能用此途径控制疾病，已成为当前研究工作的一个热点领域。carries the coding sequenceprovides the amino acid correspondin
55、g to each codona major component of the ribosome that provides the environment for protein synthesis4.4 转录产物的加工转录产物的加工 4.4.1 原核生物转录产物的加工原核生物转录产物的加工 4.4.1.1 tRNA 4.4.1.2 rRNA 4.4.1.3 mRNA4.4.2 真核生物转录产物的加工真核生物转录产物的加工 4.4.2.1 tRNA 4.4.2.2 rRNA 4.4.2.3 mRNA 4.4.1 原核生物基因转录产物的加工原核生物基因转录产物的加工4.4.1.1 tRNA加工
56、加工 E.coli基因组共有约60个tRNA基因， 原核生物的tRNA基因以多顺反子(poly-cistron)的形式被转录，转录产物都是很长的前体分子。 通常由多个相同tRNA基因或不同的tRNA串联排列，或与rRNA的基因，或与编码蛋白质的基因组成混合转录单位。 tRNA前体必须经过切割和核苷酸的修饰，才能成为有功能的成熟分子。4.4.1.1 tRNA加工加工tRNA前体分子的3-端是在多种RNase的共同参与下逐步加工成熟的，在离体条件下，这些酶是RNase P、RNase F、RNase D、RNase BN、RNase T、RNase PH、RNase II和多核苷酸磷酸化酶(pol
57、ynucleotide, PNPase)。tRNA前体分子的5-端一般都有约40nt的前导序列，可以形成RNase P能够识别的茎环二级结构，使RNase P能将tRNA前体5-端额外的核苷酸逐个切除。原核生物原核生物tRNA前体的加工前体的加工 添加添加3-端端CCA 已知所有成熟tRNA分子的3-端都有CCA-OH结构，这是氨基酸接受部位的特有结构。细菌有两类不同的tRNA前体，I型前体分子的附加序列被切除后，即显露出自身所具有的3-端CCA-OH结构。II型前体分子自身没有3-端的CCA结构，其成熟分子的CCA-OH结构是在切除3-端附加序列后，在tRNA核苷酰转移酶核苷酰转移酶的作用下
58、，逐个添加上去的。 tRNA + CTP tRNA-C + PPi tRNA-C + CTP tRNA-CC + PPi tRNA-CC + ATP tRNA-CCA-OH + PPi4.4.1.1 tRNA加工加工4.4.1.2 rRNA前体的加工前体的加工图中1所指的是RNase III的水解位置，2所指的是RNase P的水解位置，3所指的是RNase E的水解位置。4.4.1.3 mRNA前体的加工前体的加工大肠杆菌T7噬菌体早期转录区的6个基因，转录生成一条多顺反子的mRNA前体，前体分子内每个mRNA之间分别形成茎环结构。由RNase III对茎结构内不配对的小突环进行酶切，将前体
59、分子酶切成为6个成熟的mRNA，再进行各自的翻译。研究发现，这种由茎环结构调控的RNA加工有一定的普遍性。 4.4.2 真核生物转录产物的加工真核生物转录产物的加工4.4.2.1 tRNA前体的加工前体的加工 单顺反子，构成基因簇，属于复杂基因家族，单顺反子，构成基因簇，属于复杂基因家族， 。 剪切和修剪剪切和修剪 3 端端均需均需添加添加CCAOH 核苷修饰核苷修饰 内含子剪接：内含子剪接：酶促拼接酶促拼接4.4.2 真核生物转录产物的加工真核生物转录产物的加工内含子的特点是： 长度和序列没有共同性，一般有1646个核苷酸。 位于反密码子的下游(即在3-端一侧)。 内含子和外显子间的边界没有
60、保守序列，其内含子的剪接方式不符合一般规律。 真核生物tRNA前体中内含子的精确切除信号是tRNA分子高度保守的二级结构，而不是内含子的保守序列，剪接需要RNase的参与。 （1）内含子的剪接）内含子的剪接 真核生物tRNA前体分子的剪接分为两步： tRNA内切核酸酶(tRNA endonuclease)切割前体分子中的内含子； RNA连接酶(RNA ligase)将两个半分子连接在一起。4.4.2.1 tRNA前体的加工前体的加工在内切酶切割时。3-端切点生成2, 3-环磷酸，5-端切点生成-OH基；环磷酸二酯酶(cyclic nucleotide phosphodiesterase)作用下
61、，使2, 3-环磷酸水解，形成3-OH和2-磷酸基；3-端半分子的5-OH在多核苷酸激酶(polynucleotide kinase)催化下磷酸化，才能进行连接反应。在连接过程中，首先由ATP通过形成连接酶-AMP共价中间物将连接酶激活；两个外显子通过3, 5 -磷酸二酯键连接起来。多余的2-磷酸由磷酸酶水解除去。 （）在（）在3-端添加端添加-CCA 真核生物中所有tRNA前体分子均缺乏3-端的-CCA OH结构，必须在tRNA核苷酸转移酶(tRNA nucleotide transferase)催化下，由CTP和ATP提供胞苷酸和腺苷酸，添加3-端的-CCA OH结构。（）核苷酸的修饰（）
62、核苷酸的修饰 tRNA分子中稀有核苷酸很多，有多种酶参与tRNA分子核苷酸修饰，主要是多种tRNA甲基化酶，催化tRNA分子特定位置上的甲基化，例如A m7A，G55 m7G55等。此外还有一些其它类型的酶，如催化合成tRNA2-异戊烯的tRNA异戊烯转移酶，催化S4U以及含硫嘧啶化合物合成的tRNA硫转移酶等。 (1) snoRNA 已发现在酵母和人类细胞中各自有上百种snoRNA存在于核仁内，长约87275nt，能与细胞内特定的蛋白质如核仁纤维蛋白或自身免疫抗原等结合，生成核仁小分子核糖核蛋白体(snoRNP)。snoRNP可指导rRNA中核糖和碱基的修饰，参与rRNA前体的剪切，还能以类
63、似分子伴侣的形式参与rRNA高级结构的形成。4.4.2.2 rRNA前体的加工前体的加工 snoRNA分为两类。一类是C盒/D盒snoRNA，可借助互补序列识别rRNA前体中进行甲基化和切割的位点，C盒的序列为UGAUGA，D盒为CUGA。另一类是H盒/ACA盒snoRNA，含H盒(ANANNA)和ACA盒，能识别假尿苷酸()化位点。 (1) 在snoRNA指导下对45S的rRNA前体进行核苷酸修饰。 (2) 切除5-端的非编码序列，生成41S中间产物。 (3) 41S的RNA被切割为两段，一段为32S，含有28S rRNA和5.8S rRNA。另一段为20S，含有18S rRNA。 (4)
64、通过剪切和修剪，将32S片段加工成28S rRNA和5.8S rRNA，将20S片段加工成18S rRNA。 (5) 5.8S rRNA与28S rRNA的部分序列相互配对，形成核糖体大亚基的rRNA 复合物。 几种主要的修饰方式几种主要的修饰方式1. 1. 剪接剪接( (splicing) )2. 2. 剪切剪切( (cleavage) )3. 3. 修饰修饰( (modification) )4. 4. 添加添加( (addition) )5. 5. 编辑编辑( (editing) )a. 5 端添加帽子结构端添加帽子结构b. 3 端添加多聚腺苷酸端添加多聚腺苷酸c. 内含子的剪接内含子的
65、剪接4.4.2.3 真核生物真核生物mRNA前体的加工前体的加工5 端添加帽子结构端添加帽子结构* 帽子结构和类型帽子结构和类型 0、I和 II型* 加帽反应：共转录加帽反应：共转录 1) 酶 磷酸水解酶；mRNA鸟苷酸转移酶；鸟嘌呤-7-甲基转移酶 2) 步骤* 为什么只有为什么只有mRNA才会加帽？才会加帽？* 功能功能4.4.2.3 真核生物真核生物mRNA前体的加工前体的加工加帽反应加帽反应C开始于mRNA 5-三磷酸的 磷酸根的水解 g gO-P-O-P-O-P-OCH25OOOOOOO-OHO碱基RNA 链O-P-O-P-OCH25OOOOO-OHO碱基RNA 链Pi 磷酸水解酶磷
66、酸水解酶C留下的5-二磷酸进攻GTP，与GMP形成共价交联，同时释放出PPi。O-P-O-P-OCH25OOOOO-OHO碱基RNA链链mRNA鸟苷酸转移酶鸟苷酸转移酶PPiO-P-O-P-O-P-OCH2OOOOOOO-OHOHG5RNA 链链O-P-O-P-OCH25OOOOO-OHO碱基-P-OCH2OOO-OHOHG5不同寻常的 5-5 三磷酸连接C鸟嘌呤随后在鸟嘌呤随后在N7位置被甲基化，甲基供体位置被甲基化，甲基供体为为S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸 甲基转移酶甲基转移酶RNA链链O-P-O-P-OCH2OOOOO-OHO碱基-P-OCH2OOO-OHOHGRNA 链链O-P-O-P-OCH2OOOOO-OHO碱基-P-OCH2OOO-OHOHGCH35 m(7)GpppN 帽子帽子0型帽子1型帽子2型帽子可能可能 的甲的甲 基化基化 修饰修饰酵母酵母高等生物高等生物脊椎动物脊椎动物5帽子的生物学意义帽子的生物学意义C提高提高mRNA的稳定性的稳定性C参与识别起始密码子的过程，提高参与识别起始密码子的过程，提高mRNA的可翻译性的可翻译性C有助于有助于mRNA通过核孔从细胞核运输通过
