干扰素的工艺制备流程
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1、基因工程药物 -干扰素的制备 1 什么是干扰素u概念(interferon,IFN)：机体免疫细胞产生的一类细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。u根据分子结构和抗原性的差异分为、等4个类型。1.1天然干扰素的分类天然干扰素的分类 1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类 I 型干扰素：IFN、IFN、IFN 、IFN 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 、免疫调节(较弱） 其中IFN-为多基因产物，有23种以上的亚型。 II 型干扰素：干扰素（IFN) 来源：活化的T细胞和NK细胞产
2、生 功能：免疫调节 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要） 2.2. 根据动物来源确定分类 人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。v不同来源的干扰素1.2 重组干扰素的临床应用重组干扰素的临床应用v广谱抗病毒活性（rhuIFN） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。v直接抗肿瘤活性（rhuIFN） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。v免疫调节活性治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFN）v多发性硬化症 rhuIFN2 基因工程大肠杆菌发酵生产工
3、艺基因工程大肠杆菌发酵生产工艺干扰素生产工艺路线干扰素生产工艺路线上市产品：重组人干扰素rhuIFN 1986，rhuIFN-2a， rhuIFN-2b； 1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b； 20012002： PEG化IFN，PEG-Intron, Pegasys 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。基因工程大肠杆菌发酵生产工艺基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:v目的基因的分离目的基因的分离克隆载体克隆载体目的基因与克隆目的基因与克隆载体的体外重组载体的体外重组重组体导入大肠杆菌重组体导入大肠杆菌K12K12受体菌的培养及
4、筛选受体菌的培养及筛选从受体菌中获取目的基因从受体菌中获取目的基因表达载体表达载体重组质粒重组质粒导入大肠杆菌导入大肠杆菌受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测工工程菌程菌 基因工程菌的制备一、目的基因的分离与扩增v1. 破碎细胞，用Trizol法提取总的RNAv2. 将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶电泳切取目的基因片段v3. 用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNAv4. 以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干扰素基因的PCR产物v5.人工加尾形成“粘性末端”二、构建重组质粒v1. 提取载体（质粒、病毒等），双酶切
5、，再把干扰素基因的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接E EcocoR IR IB BamamH IH IE EcocoR IR IB BamamH IH I 2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。 3.鉴定序列无误后，导入受体细胞，筛选三、重组体引入宿主细胞 将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。四、受体菌的筛选 由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况 五、分析保存
6、 对基因工程大肠杆菌进行评价分析，并保存菌种。干扰素的发酵工艺过程启开种子启开种子 制备种子液制备种子液 发酵培养发酵培养 粗提粗提 精提精提 半成品制备半成品制备 半成品检定半成品检定 分装分装 冻干冻干 成品检定成品检定 成品包装成品包装v1 1菌种培养菌种培养 取70下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30，pH7.0，250 r/min活化培养182小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。v2 2种子罐培养种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培
7、养34小时，转入发酵罐中，同时取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌 v3.3.发酵罐培养发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20，pH6.0，溶解氧60%，继续培养56.5小时。同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.01.0后，用5冷却水快速降温至15以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10以下。v4. 4. 菌体收集菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含
