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1、细胞培养技术细胞培养技术蔺帅2013年4月主要内容主要内容细胞简介细胞简介1细胞培养技术平台细胞培养技术平台2HEK293T细胞的培养具体方法与步骤细胞的培养具体方法与步骤3细胞培养的常见问题与解决方案细胞培养的常见问题与解决方案4细胞间的操作注意事项细胞间的操作注意事项5细胞简介细胞简介v细胞是生命活动的基本单位细胞是生命活动的基本单位 16651665年英国学者年英国学者Robert HookeRobert Hooke，用自制的显微镜观察软木的，用自制的显微镜观察软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文CellaCella（小室
2、）词（小室）词. .细胞简介细胞简介v细胞是生命活动的基本单位细胞是生命活动的基本单位 1983-391983-39德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立了了“细胞学说细胞学说”的基本原则的基本原则 1 1、细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的、细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的 2 2、每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己的、每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己的“生命生命” 3 3、新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生、新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生 细胞培养技术平台细胞培养技术平台药物筛选药物筛选基因诊疗基因诊疗治病机理治病机理组织工程组织工
3、程基因诊断基因诊断试管婴儿试管婴儿培养细胞培养细胞能做什么能做什么细胞的培养具体方法与步骤细胞的培养具体方法与步骤v 细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养(cell culture) (cell culture) 的含义，简单地说即是的含义，简单地说即是把来把来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境中生存中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、殖、衰老等生命现象。细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、病
4、毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用v原代培养原代培养v传代培养传代培养细胞的培养具体方法与步骤细胞的培养具体方法与步骤v原代培养原代培养 用直接从机体获得的细胞进行的培用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养养称为原代培养。这种培养过程主。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。原代培养是建立各种生长和繁殖。原代培养是建立各
5、种细胞系的第一步。细胞系的第一步。细胞的培养具体方法与步骤细胞的培养具体方法与步骤v传代培养传代培养 传代培养是传代培养是指细胞从一个培养瓶以指细胞从一个培养瓶以1 1：2 2或其他比率转移，接种到或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。代法或离心法传代。HEK293THEK293T和和HEK293HEK293细胞细胞vHEK293HEK293细胞简介细胞简介HEK293细
6、胞在倒置显微镜下的形态细胞在倒置显微镜下的形态HEK293THEK293T和和HEK293HEK293细胞细胞vHEK293HEK293细胞简介细胞简介 HEK293HEK293细胞株细胞株是转染腺病毒是转染腺病毒E1AE1A基因的基因的人胚肾上皮细胞人胚肾上皮细胞，由于，由于容易转染且容易培养，常被用于转染试验容易转染且容易培养，常被用于转染试验。 HEK293THEK293THEK293HEK293SV40大大T抗原抗原瞬时转染瞬时转染稳定转染稳定转染转染效率更高转染效率更高HEK293THEK293T和和HEK293HEK293细胞细胞v瞬时转染瞬时转染 在瞬时转染中重组在瞬时转染中重组
7、DNADNA导入感染性强的细胞系已导入感染性强的细胞系已获得目的基因暂时但高获得目的基因暂时但高水平的表达水平的表达。转染的。转染的DNADNA不必整合进宿主染色体不必整合进宿主染色体，当用大量的，当用大量的样品需要在样品需要在短时间内分析时短时间内分析时，尤其是在转然后的，尤其是在转然后的1-41-4天内收获细胞，所得的溶解产物天内收获细胞，所得的溶解产物用于检测目的基因的表达，可以采用瞬时表达的方式。用于检测目的基因的表达，可以采用瞬时表达的方式。v稳定转染稳定转染 这种细胞系中转染的这种细胞系中转染的目的基因整合到宿主染色体目的基因整合到宿主染色体DNADNA中中并指导并指导适量的目的适
8、量的目的蛋白的合成蛋白的合成。一般来说转染细胞的效率要比瞬时转染的效率低。一般来说转染细胞的效率要比瞬时转染的效率低1-21-2个数量个数量级。级。HEK293HEK293细胞细胞vHEK293HEK293细胞生长条件细胞生长条件 完全培养基完全培养基 10% 10%的胎牛血清的胎牛血清 DMEM(4.0mM L- DMEM(4.0mM L-谷氨酰胺谷氨酰胺 4500mg/ml4500mg/ml葡萄糖葡萄糖 ) ) 1% 1%双抗双抗(1000units /L penicillin 1000mg/L streptomycin)(1000units /L penicillin 1000mg/L
9、streptomycin) 3737 5%CO5%CO2 2无菌技术无菌技术v 制定好实验计划和操作程序制定好实验计划和操作程序（准备好实验过程中的一（准备好实验过程中的一切用品）切用品）v 洗手和着装洗手和着装（75%75%酒精消毒）酒精消毒）v 进入超净台中的所有物品均需消毒进入超净台中的所有物品均需消毒v 操作野消毒操作野消毒细胞培养耗材细胞培养耗材HEK293HEK293细胞的传代细胞的传代v 待细胞的融合率达到待细胞的融合率达到90%90%时进行传代。时进行传代。弃去旧细胞液弃去旧细胞液 4 4遇冷的遇冷的DPBSDPBS（不含（不含CaCa2+ 2+ 、MgMg2+2+）4ml4m
10、l冲洗后弃液冲洗后弃液 加入加入0.05%0.05%（3737 预温预温 ）胰酶消化）胰酶消化 加入加入12ml12ml完全培养基（完全培养基（3737 预温预温 ）将细胞从细胞瓶底部冲下）将细胞从细胞瓶底部冲下 1:4 1:4传代即取传代即取3ml3ml细胞悬液加入有细胞悬液加入有9ml9ml完全培养基的新细胞瓶中完全培养基的新细胞瓶中 放入放入3737、5%CO25%CO2继续培养继续培养HEK293HEK293细胞的传代细胞的传代v加入加入0.05%0.05%胰酶消化胰酶消化1 1刚加入胰酶细胞还是致密单层2 2细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态 3 3细胞明显皱缩变小，细胞间隙增
11、大不再致密，部分细胞维持正常形态，部分细胞皱缩变圆 4细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下。 5 5如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。HEK293HEK293细胞的传代细胞的传代v HEK293HEK293细胞的冻存细胞的冻存v 随着传代的次数增加，随着传代的次数增加，293293细胞会出现生长状态下降，细胞会出现生长状态下降，出现突变等出现突变等。所以要在细胞购进时就进行大量冻存，。所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。以保证实验的稳定性和持续性。v 在细胞在细胞对数生长期对数生长期进行冻存，进行冻存，增加细胞复苏成活率增加细胞复苏成活率。v 原则：慢
12、冻原则：慢冻HEK293HEK293细胞的冻存细胞的冻存v冻存前的准备冻存前的准备v DMEMDMEM完全完全培养基培养基( (含含10%10%胎牛血清胎牛血清) )：试验前置室温下。：试验前置室温下。v 0.05%0.05%的胰酶消化液：的胰酶消化液：3737预温。预温。v 程序冻存盒（加程序冻存盒（加250ml250ml异丙醇）、二甲基亚砜异丙醇）、二甲基亚砜(DMSO)(DMSO)、2ml2ml细胞冻细胞冻存管存管（标记标记细胞名称、代数、日期细胞名称、代数、日期）、DPBSDPBS（不含钙镁（不含钙镁）HEK293HEK293细胞的冻存细胞的冻存v冻存前的准备冻存前的准备HEK293H
13、EK293细胞冻存步骤细胞冻存步骤配制细胞冻存液配制细胞冻存液 取取50ml50ml无菌离心管，于超净台内，加入适量无菌离心管，于超净台内，加入适量DMEMDMEM培养基培养基( (含含10%10%胎牛血清胎牛血清) )，再逐滴加入再逐滴加入二甲基亚砜二甲基亚砜(DMSO)(DMSO)至至20%20%浓度浓度，即，即制成双倍的冻存液，置室温下待用制成双倍的冻存液，置室温下待用。HEK293HEK293细胞冻存步骤细胞冻存步骤 取准备冻存的细胞，弃去培养基，以取准备冻存的细胞，弃去培养基，以DPBS2-3mlDPBS2-3ml洗细胞一次洗细胞一次加入加入0.5-1.0ml 0.05%0.5-1.
14、0ml 0.05%的胰酶的胰酶消化消化加入新鲜培养基加入新鲜培养基10-12ml10-12ml吹打成细胞悬液吹打成细胞悬液收集细胞悬液至收集细胞悬液至50ml50ml无菌离心管，无菌离心管，1000rpm1000rpm，5min5min离心离心. .弃上清，加入适量培养基弃上清，加入适量培养基取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，DMSODMSO最后浓度为最后浓度为10%10%HEK293HEK293细胞冻存步骤细胞冻存步骤 细胞浓度为细胞浓度为1 15 5106cells/ml106cells/ml（细胞计数细胞计数），分装于已标示完全
15、之细胞冻存管中，分装于已标示完全之细胞冻存管中将细胞冻存管放入程序冻存盒中（已加将细胞冻存管放入程序冻存盒中（已加250ml250ml异丙醇），置异丙醇），置-80-80超低温冰箱超低温冰箱第二天将细胞放入第二天将细胞放入液氮灌液氮灌，并记录，并记录HEK293HEK293细胞冻存步骤细胞冻存步骤v细胞冻存的注意事项细胞冻存的注意事项 欲冷冻保存之细胞应在生长良好且存活率高之状态欲冷冻保存之细胞应在生长良好且存活率高之状态 冷冻保护剂之品质。冷冻保护剂之品质。DMSODMSO应为试剂级等级，无菌且无色，以应为试剂级等级，无菌且无色，以小体积分装，小体积分装，44避光保存避光保存 低温损伤主要发
16、生在低温损伤主要发生在00-60-60这一温度区内这一温度区内，这一温度范这一温度范围内围内不宜不宜过久过久HEK293HEK293细胞的复苏细胞的复苏v 当细胞传代次数过多当细胞传代次数过多( (超过超过5050代代) )，细胞状态变差时或细胞状态变差时或细胞出现污染事故时细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏进行复苏v 原则：快复原则：快复HEK293HEK293细胞的复苏细胞的复苏v复苏前的准备复苏前的准备v DMEMDMEM完全完全培养基培养基( (含含10%10%胎牛血清胎牛血清) )：试验前置室温下：试验前置室温下v 将水浴锅预热至将水浴
17、锅预热至3737v 取新培养瓶（取新培养瓶（75cm275cm2），标记细胞编号、时间，加入），标记细胞编号、时间，加入10ml DMEM10ml DMEM培培养基养基(37(37预热预热) )，润湿底面，润湿底面HEK293HEK293细胞复苏步骤细胞复苏步骤 根据冻存记录从液氮灌中取出冻存的细胞根据冻存记录从液氮灌中取出冻存的细胞迅速投入已经预热至迅速投入已经预热至37 37 的水浴锅的水浴锅中，并快速晃动，在中，并快速晃动，在1-2 min1-2 min内使完全融化内使完全融化用酒精擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内用酒精擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内，有，有培养基的培养瓶培养基的培养瓶
18、轻轻混匀，置轻轻混匀，置3737、5%CO25%CO2培养箱中培养培养箱中培养次日换液次日换液细胞培养的常见问题与解决方案细胞培养的常见问题与解决方案v一、细胞培养污染问题一、细胞培养污染问题v二、二、何时须更换培养基何时须更换培养基v三、三、可否使用与原先培养条件不同之培养基可否使用与原先培养条件不同之培养基v四、四、细胞冷冻管解冻培养时，细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去是否应马上去除除DMSODMSO细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v细胞污染细胞污染 细胞培养中最大的敌人细胞培养中最大的敌人污染污染 包括所有混入培养环境中包括所有混入培养环境中对细胞生存有害的成份和造成细胞
19、对细胞生存有害的成份和造成细胞不纯的异物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质及细不纯的异物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质及细胞胞细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v细胞污染的原因细胞污染的原因 无菌操作技术不当无菌操作技术不当 操作室环境不佳操作室环境不佳 培养基或者血清的污染培养基或者血清的污染细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v细胞的细菌污染细胞的细菌污染 最常见的有最常见的有革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以。，如枯草杆菌以。革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌，如如大肠杆菌、假单胞菌等。大肠杆菌、假单胞菌等。其中又以白色葡萄球菌较常见。其中又以白色葡萄球菌较常见。
20、 细菌污染后，细菌污染后，会很快出现培养液变混浊会很快出现培养液变混浊，pHpH改变。也有少数改变。也有少数培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v细胞的细菌污染检测细胞的细菌污染检测 16S RNA PCR16S RNA PCR法法 细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v 常见的细菌污染常见的细菌污染白色链球菌污染以及革兰氏染色图片白色链球菌污染以及革兰氏染色图片细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v细胞的真菌污染细胞的真菌污染 梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染
21、培养细胞的多为烟曲梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。 真菌污染后，真菌污染后，霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物漂浮物。细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v细胞的真菌污染检测细胞的真菌污染检测 镜检有丝状物镜检有丝状物细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v 常见的真菌污染常见的真菌污染真菌污染真菌污染霉菌污染霉菌污染细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v细胞的支原体污染细胞的支原体污染 细胞培养过程中，细
22、胞培养过程中，支原体感染发生率达到支原体感染发生率达到63%63%，因而细胞培养因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题过程中被支原体污染是一个世界性的难题 细胞被支原体污染后，细胞被支原体污染后，细胞内的细胞内的DNADNA、RNARNA及蛋白表达发生改及蛋白表达发生改变变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被因而细胞被支原体污染一般难以察觉支原体污染一般难以察觉。细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v细胞的支原体污染检测细胞的支原体污染检测 试剂盒检测法：试剂盒检测法： 目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片进行检
23、目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片进行检测测间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v 常见的支原体污染常见的支原体污染支原体污染的电镜下图片支原体污染的电镜下图片细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v细胞污染的解决方法细胞污染的解决方法 控制环境污染；严格实验操作控制环境污染；严格实验操作 原则上弃掉原则上弃掉 加抗生素加抗生素 污染后清除用药需采用大于常用量污染后清除用药需采用大于常用量5 51010倍的冲洗法，于加药倍的冲洗法，于加药后作用后作用24244848小时，再换常规
24、培养液。此法在污染早期有效。小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v细胞污染的解决方法细胞污染的解决方法 加抗生素加抗生素细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v何时需更换细胞液何时需更换细胞液 视细胞生长密度而定，视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可按时更换培养基即可细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v何时需更换细胞液何时需更换细胞液 视细胞生长密度而定，视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基
25、即可按时更换培养基即可细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v可否使用与原先培养条件不同之培养基可否使用与原先培养条件不同之培养基 不能不能，每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基若每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无细胞大都无法立即适应，法立即适应， 造成细胞无法存活造成细胞无法存活细胞污染问题与解决方案细胞污染问题与解决方案v细胞冷冻管解冻培养时，细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去是否应马上去除除DMSODMSO 除少数特别注明对除少数特别注明对DMSO DMSO 敏感之
26、细胞外，敏感之细胞外， 绝大部分细胞株绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后，在解冻之后， 应直接放入含有应直接放入含有10-10-15ml15ml新鲜培养基之培养角瓶中，新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以待隔天再置换新鲜培养基以去除去除DMSO DMSO 即可即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。贴附之问题。细胞间的操作注意事项细胞间的操作注意事项v未经许可，任何人不得进入细胞间。未经许可，任何人不得进入细胞间。v不得在细胞间内做任何与试验无关之事。不得在细胞间内做任何与试验无关之事。v不得携带
27、任何与实验无关或可能导致污染的物品进入细胞间不得携带任何与实验无关或可能导致污染的物品进入细胞间。v必须随时保持细胞间的整洁、卫生，及时清理杂物、垃圾。必须随时保持细胞间的整洁、卫生，及时清理杂物、垃圾。v所有设备、物品，使用后必须及时归位。所有设备、物品，使用后必须及时归位。v进入细胞间必须更换细胞间专用拖鞋与工作服。不得将细胞间专用拖鞋与工作进入细胞间必须更换细胞间专用拖鞋与工作服。不得将细胞间专用拖鞋与工作服传出细胞间外。服传出细胞间外。v进入细胞间必须养成随手关门习惯。操作期间，细胞间外门和中门必须处于关进入细胞间必须养成随手关门习惯。操作期间，细胞间外门和中门必须处于关闭状态。闭状态
28、。LOGO细胞间的操作注意事项细胞间的操作注意事项v操净工作台实验前和试验后的灭菌，打开紫外灯操净工作台实验前和试验后的灭菌，打开紫外灯15-2015-20分钟。分钟。v试验操作期间，应戴手套。并注意随时用试验操作期间，应戴手套。并注意随时用75%75%酒精消毒双手。酒精消毒双手。v实验操作期间，操净工作台的风机应处于打开状态。操作结束后，关闭挡板、实验操作期间，操净工作台的风机应处于打开状态。操作结束后，关闭挡板、关闭风机。关闭风机。v凡是带入操净工作台内的酒精、凡是带入操净工作台内的酒精、PBSPBS、培养基、胰蛋白酶等到额瓶子均要用、培养基、胰蛋白酶等到额瓶子均要用75%75%酒精擦拭瓶
29、子的外表面。酒精擦拭瓶子的外表面。v使用倒置显微镜前，用使用倒置显微镜前，用75%75%酒精擦拭消毒载物台酒精擦拭消毒载物台v使用二氧化碳培养箱时，应尽量缩短开门时间，减少开门次数。使用二氧化碳培养箱时，应尽量缩短开门时间，减少开门次数。v每次倒置显微镜观察细胞后，用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，再放入每次倒置显微镜观察细胞后，用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，再放入放入培养箱中继续培养。放入培养箱中继续培养。LOGO细胞间的操作注意事项细胞间的操作注意事项v每一个人操作结束后，必须及时清理操净工作台内的物品，不得在工作台内留每一个人操作结束后，必须及时清理操净工作台内的物品，不得在工作
30、台内留置或堆积杂物。置或堆积杂物。v清理操净工作台后，用清理操净工作台后，用75%酒精擦拭消毒操净工作台面。酒精擦拭消毒操净工作台面。v每一个操作结束后，必须及使用每一个操作结束后，必须及使用84消毒液消毒管道，并清理废液瓶，及时弃去消毒液消毒管道，并清理废液瓶，及时弃去废液。废液。v操作结束后，确认倒置显微镜电源关闭。操作结束后，确认倒置显微镜电源关闭。v操作结束后，确认二氧化碳培养箱的两道门均处于关闭状态。操作结束后，确认二氧化碳培养箱的两道门均处于关闭状态。v离开细胞间前，确认空调已关闭（夏季高温季节除外）。离开细胞间前，确认空调已关闭（夏季高温季节除外）。v每日最后一人离开细胞间前，打开紫外灯消毒。每日最后一人离开细胞间前，打开紫外灯消毒。v进入或离开细胞间时，注意观察二氧化碳钢瓶上的压力表压力是否正常（减压进入或离开细胞间时，注意观察二氧化碳钢瓶上的压力表压力是否正常（减压阀出气口的压力应在阀出气口的压力应在0.06-0.08Mpa之间）。之间）。v注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。v定期打扫细胞间：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、操净工作台等，定期打扫细胞间：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、操净工作台等，然后用然后用3苏尔或者新洁尔灭或者苏尔或者新洁尔灭或者5%过氧乙酸擦拭过氧乙酸擦拭
