第五章 基因工程载体
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1、1第五章第五章. 基因工程载体基因工程载体2载体类型基因工程所用的载体都经过人工重新构建 细菌质粒载体 噬菌体衍生载体 Cosmid载体（粘粒） 噬菌体M13衍生载体 Phagemid载体 酵母质粒载体 真核病毒载体3克隆载体与表达载体克隆载体：携带外源DNA进入受体细胞并 使外源DNA大量扩增。表达载体：表达外源基因编码的蛋白质，载体克隆位点的上游应含有启动子，下游含有转录终止序列。4第一 节. 质粒 Plasmid质粒是存在于细菌细胞染色体外、能自主复制的小分子环状双链DNA分子。又称为cccDNA（Covalently Closed Circular DNA）。5野生型质粒的大小一般在2
2、-200Kb 基因工程常用质粒在2-4Kb之间 质粒并不是细菌生长所必须的，但可为宿主执行一定的遗传功能，如抗生素的抗性、重金属离子的抗性、细菌毒素的分泌等。6质粒质粒 (plasmid)71 .质粒类型: 严紧型质粒(stringent plasmid)1-5个拷贝/细胞 松弛型质粒(relaxed plasmid):数十个/细胞质粒在细胞中的拷贝数有时与寄主的种类有关。82. 质粒载体必须具备的条件（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。在，有较高的拷贝数。（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行
3、选择，如抗生素的抗性基因，主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。）等。9（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点有外于外源基因的插入。如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。活，而便于筛选。10质粒性质不相容性（不亲和性） 具有相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒，不能稳定的存在于同一受体细胞内，这种现象称作质粒的不相容性。 113. 质粒载体的选择性标记 抗菌素抗性 新陈代谢特性12 抗菌素名称抗菌素名称 抗
4、菌素作用方式抗菌素作用方式 宿主菌抗性机理宿主菌抗性机理氨苄青霉素（氨苄青霉素（Amp） 干扰细菌细胞壁合成干扰细菌细胞壁合成 编码编码 -内酰胺酶内酰胺酶,切割切割Amp -内酰胺环内酰胺环氯霉素（氯霉素（Cml） 抑菌剂抑菌剂,与与50S结合结合,干扰干扰 编码乙酰转移酶编码乙酰转移酶,使使氯霉素氯霉素 蛋白质蛋白质合成合成 乙酰化失活乙酰化失活卡那霉素（卡那霉素（Kan） 杀菌剂杀菌剂,与与70S结合结合,mRNA 编码氨基糖苷磷酸转移酶编码氨基糖苷磷酸转移酶, 发生错读发生错读 修饰修饰Kan失活失活链霉素链霉素（Sm） 杀菌剂杀菌剂,与与30S结合结合,mRNA 编码特异修饰酶编码特
5、异修饰酶 发生错读发生错读四环素（四环素（Tet） 抑菌剂抑菌剂,与与30S结合，阻止结合，阻止 编码特异蛋白编码特异蛋白,修饰细菌膜修饰细菌膜 蛋白合成蛋白合成 结构结构,阻止阻止Tet通过细胞膜通过细胞膜13复制起点氨苄青霉素抗性基因14常用的质粒载体1.pBR3222.220载体是我国预防医学科学院病毒研究所自行构建的大肠杆菌温控表达载体。3.pUC系列:如pUC118、pUC119，两者之间的差别在于多克隆位点不同。151617184.融合表达载体如GST融合表达系统。载体中含有细菌的谷胱甘肽巯基转移酶（GST）基因，外源基因克隆在GST基因的下游。当基因表达时，表达产物为GST与目的
6、蛋白的融合体。19融合表达载体的优点 表达效率高 融合蛋白易纯化： 抗GST的蛋白质作为特异性抗体， 用亲和层析法从细胞裂解液中纯化出融合蛋白； 可从融合蛋白中分离出单一的外源蛋白质GST与外源蛋白之间克隆上蛋白酶的切割位点，可用适当的酶切割。20例如加装一段编码Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序列的人工接头片断，该片断可被具有蛋白酶活性的凝血因子a切割，从Arg后切开。目的蛋白中出现此种序列的可能性极小，因此该方法用途广泛。21QIAexpress 6His表达系统 重组蛋白质的末端带有6个组氨酸残基，对带有Ni离子的层析介质有高度的亲和力，易于纯化。 6个组氨酸残基质量小，不影响蛋白质的
7、结构和功能，无需切除。 6个组氨酸残基免疫原性差，重组蛋白可以直接用做抗原。22第二节第二节 噬菌体类噬菌体类 噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文名为名为Bacteriophage,简称简称phage。噬菌体可。噬菌体可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但必须依赖寄主细胞才能复制生长。命，但必须依赖寄主细胞才能复制生长。23噬菌体（bacteriophage, phage） 噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 病毒的特性： 个体微小，可以通过细菌滤器 没有完整的细胞结构，由蛋白质和核酸组成 专性细胞内寄
8、生的微生物 可分为12个科24噬菌体的生物学性状25噬菌体的生物学性状 形态 个体小，需用电子显微镜观察 蝌蚪形、微球形和丝形The black bars are size bars representing 100 nm. 262728 用作克隆载体的噬菌体有两类：一类是用作克隆载体的噬菌体有两类：一类是噬菌体，另一类是噬菌体，另一类是M13噬菌体。噬菌体。 野生型野生型噬菌体经过改造，已衍生出噬菌体经过改造，已衍生出100多多种克隆载体。种克隆载体。 噬菌体载体分为插入型和替换噬菌体载体分为插入型和替换型型(置换型置换型)两类。两类。 目前应用较广的是目前应用较广的是EMBL系列、系列、g
9、t系列和系列和Charon系列等。系列等。 29噬菌体（lambda phage) 噬菌体是可以感染细菌的病毒，是大肠杆菌的温和型噬菌体。由外壳蛋白外壳蛋白与一个48.5kb的双链线状双链线状DNA分子组成。经过改造形成的噬菌体载体有较高的转化效率。30在在噬菌体DNA分子双链的5端，各有一段由12个核苷酸组成的互补的单链凸出序列，即通常所说的黏性末端。在寄主细胞内，会通过黏性末端的互补作用，形成环型双链DNA分子。这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点。（cos : cohensive end site)31 3CCCGCCGCTGGAGGGCGGCGACCT3 在黏性末端的12个碱
10、基中，有10个是GC。通过碱基配对线性分子环化起来，由此形成的双链区，叫做cos位点。32 噬菌体基因组含50余个基因，功能相近的基因聚集成簇。有些基因对噬菌体的生长不是必须的，可以被外源DNA片段取代。 噬菌体上有56种限制性内切酶的识别位点，约300余切点。比如BamHI分别在第5505、22346、27972、34499和41732处有识别位点。 33噬菌体的生长途径 噬菌体有溶原和溶菌两种生长途径。 溶原生长途径是指噬菌体的DNA整合在宿主染色体上，随宿主染色体的复制而复制。以原噬菌体的形式潜伏起来。一旦宿主细胞处于某种条件下时， 噬菌体的DNA脱离染色体，重新进入溶菌生长途径。34
11、溶菌生长是指噬菌体在宿主细胞中黏性末端连接，成为环形DNA分子，借用宿主细胞的体系，合成病毒包装所需的外壳蛋白，新复制的DNA与外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。宿主细胞膜在R蛋白和S蛋白的作用下破裂，释放出大量子代噬菌体颗粒，感染新的细胞。35噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)36M13噬菌体 单链DNA,基因组含6407个碱基.经过基因改造后，形成M13mp系列。 可容纳远大于自身基因组的外源DNA,(7倍). M13噬菌体感染细胞后,不裂解宿主细胞,但妨碍宿主细胞的生长,因此可见培
