无菌方法试验（直接接种法）

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1、xxx 有限公司xxx 无菌方法验证方案编制：日期：审核：日期：批准：日期：51、验证目的确认样品的xx 样品的抑菌活性，证明所采用的的方法适用于其无菌检查。2、验证依据中国药典xx 版四部3、试验所采用的试剂设备3.1 培养基0.9%氯化钠溶液批号：生产厂家：胰酪大豆胨液体培养基批号：生产厂家：硫乙醇酸盐流体培养基批号：生产厂家：3.2 菌种金黄色葡萄球菌cmcc（B）26003 批号： 生产厂家： 大肠埃希菌cmcc（B）44102 批号： 生产厂家： 生孢梭菌cmcc（B）64941 批号： 生产厂家： 枯草芽孢杆菌cmcc（B）63501 批号： 生产厂家： 白色念珠菌cmcc（F）9

2、8001 批号： 生产厂家： 黑曲霉cmcc（F）98003 批号： 生产厂家：3.2 设备生物安全柜编号：型号：生化培养箱编号：型号：霉菌培养箱编号：型号：4、实验方法4.1 采用直接接种法进行无菌检查方法验证。4.2 试验组取x 件包装样品以无菌操作方式打开，将样品分别投入能完全浸没样品的硫乙醇酸盐流体培养基 3 管和胰酪大豆胨液体培养基 3 管，其中硫乙醇酸盐流体培养基分别接入不大于 100cfu 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和生孢梭菌，胰酪大豆胨液体培养基分别接入不大于 100cfu 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉。其中硫乙醇酸盐流体培养基 30-35培养箱培养，胰酪大豆胨液体培养

3、基置20-25培养箱培养，培养时间不得超过 5 天，逐日观察，结果见表一。4.3 阳性对照组取硫乙醇酸盐流体培养基分别接入不大于 100cfu 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和生孢梭菌，胰酪大豆胨液体培养基分别接入不大于 100cfu 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉。其中接种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和生孢梭菌置 30-35培养箱培养，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉置 20-25培养箱培养，培养时间不得超过 5 天，逐日观察，结果见表一。4.4 阴性对照组不采集样品，不加菌，同试验组方法，即空白硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。培养 14 天，逐日观察，结果见表二。

4、4.5 样品组取样品，同试验组操作，分别加硫乙醇酸盐流体培养基管和胰酪大豆胨液体培养基管中，其中硫乙醇酸盐流体培养基 30-35培养箱培养，胰酪大豆胨液体培养基置 20-25培养箱培养，培养 14 天，逐日观察，结果见表二。5、结果表一试验组和阳性对照组培养结果组别试验菌培养时间（天）12345试验组金黄色葡萄球菌大肠埃希菌生孢梭菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉阳性对照组金黄色葡萄球菌大肠埃希菌生孢梭菌枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉表二样品组和阴性对照组培养结果组别培养基培养结果（天）1234567891011121314阴性对照组硫乙醇酸盐流体培养基胰酪大豆胨液体培养基样品组硫乙醇酸盐流体培养基胰酪大豆胨液体培养基注：表中“+”表示有菌生长，表中“-表示无菌生长” 6、结论通过表一和表二可以看出，采用直接接种法，与阳性菌相比，加入的 6 种菌均可以正常生长，因此可以使用此方法作为xx 的无菌检查方法，其中，阳性对照菌为金黄色葡萄球菌。注：如抑制某种菌，则按照药典选择相应的相应的对照菌种。