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1、Scientific method-from idea to discoveriesReading a paper 文献阅读（核心问题）Experimental design research proposal 实验设计（方法思路） Trust authorities risk assessment Doing experiment and research 实验操作（实验要点）How to enter information into the notebook 实验记录Writing a paper 实验报告Making a presentation 课堂讨论Getting fundedSc
2、ientific integrity 科学道德实验设计的基本原则Trust authorities (文献、仪器、实验材料、试剂、有经验者等）；Risk assessment （实验周期、材料等）；实验最佳条件的选择；对照实验：证明和确定结果的可靠性，排除可能出现的非特异性反应；极大地提高实验的成功率，节省时间和经费，具有普遍意义的有效的工作思维方式。 第一节、细胞形态结构的观察方法 第二节、细胞组分的分析方法 第三节、细胞培养、细胞工程与显微操作技术第四节、用于细胞生物学研究的模式生物第四节、用于细胞生物学研究的模式生物由于基因在进化上的保守性以及遗传密码的通用性，使不同物种享有共同的分子机
3、制。模式生物通常具有个体较小，容易培养，操作简单，生长繁殖快的特点。常用的模式生物第一节、细胞形态结构的观察方法 一、 光学显微镜技术（light microscopy） 二、电子显微镜技术 (electron microscopy) 三、扫描遂道显微镜 (scanning tunnel microscope ) 第二节、细胞组分的分析方法一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物二、细胞内核酸、蛋白质、糖与脂质等成分的显示方法三、特异蛋白抗原的定位与定性四、细胞内特异核酸序列的定位与定性五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态 六、定量细胞化学分析技术第三节、细胞培养、
4、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养二、细胞工程 一、光学显微镜技术（light microscopy)普通复式光学显微镜技术相差和微分干涉显微镜技术荧光显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术荧光共振能量转移技术荧光漂白恢复技术二、 电子显微镜技术 1932年德国学者Ernst Ruska用波长比光短得多的电子束作光源,发明了第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率。电子显微镜的基本知识 电镜与光镜的区别 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术介绍 超薄切片的制备过程与要求和电镜样品的染色 负染色技术（Negative staining）与金属投影 复膜与冰冻蚀刻技术（Free
5、ze etching） 扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM） 三、扫描遂道显微镜（scanning tunnel microscope,STM)原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 特点：具有原子尺度的高分辨本领,侧分辨率为0.10.2nm，纵分辨率可达0.001nm）； 可在真空、大气、液体等多种条件下工作； 非破坏性测量。用途：纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。
6、利用扫描隧道电子显微镜观察到的DNA分子普通复式光学显微镜技术 分辨率是指区分开两个质点间的最小距离光镜样本制作荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）荧光显微镜的原理荧光显微镜的应用直接荧光标记技术间接免疫荧光标记技术绿色荧光蛋白：在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位 从发光水母中提取的蛋白，在蓝光的激发下，GFP发出绿光。该基因已被克隆（由238氨基酸构成），并进行了各种改造使其荧光更强，或者可发出不同波长的荧光，现在被广泛用作报告基因。直接荧光标记技术 利用细胞不同组分对不同荧光染料具有特异的吸附作用，对样品进行荧光染色。标记荧光染料的样品在荧光显微镜下
7、经过不同波长的激发光激发后会发生不同颜色的荧光。 常用的荧光染料有以下几种： DAPI：具有很好的DNA专一性 Fluorescein（荧光素）受到蓝光激发后发绿色荧光 rhodamine（罗丹明）受到黄绿光激发后发红色荧光 Cy3，受到激发后发橙色荧光 间接免疫荧光标记技术 由于直接荧光标记后样品产生的荧光强度较弱，同时无法特异性地显示细胞内生物大分子，因此在此基础上发展起了间接免疫荧光标记技术。通过荧光标记的抗体与细胞内特异蛋白分子的结合来显示这些蛋白分子在细胞中的分布。抗原抗原抗体特异性结合免疫荧光标记免疫酶标记 利用较短波长的光使样品中荧光染料受到激发产生较长波长的荧光，用来检测各种荧
8、光分子的存在、分布及相对量，这种显微镜称为荧光显微镜。 根据激发光的路径不同，可将荧光显微镜分为透射式和落射式两种类型。激光扫描共焦显微镜技术（Laser Scanning Confocal Microscopy）原理应用：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率；通过光学切片，可重构样品的三维结构。相差和微分干涉显微镜技术相差显微镜（phase-contrast microscope） 将光程差或相位差转换成振幅差(通过物镜后“相位板”的作用），可用于观察活细胞 。微分干涉显微镜（differential-interference microscope） 以平面偏振光为光源，光线经棱
9、镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相临部位，然后再经过另一棱镜将这两束光线会合，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差并具有很强立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy)荧光共振能量转移技术 （fluorescence resonance energy transfer,FERT)原理：当供体发射的荧光与受体发射团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，产生FERT现象。在体内，如果两个蛋白质分子的距离在10nm以内，一般认为这两个蛋白质分子存在直接的相互作
10、用。应用：用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。荧光漂白恢复技术 （fluorescence recovery after photobleaching,FRAP)原理：利用高能量激光束的照射使特定区域的荧光发生不可逆的淬灭，光漂白区荧光的恢复可通过非漂白区的荧光标记分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。根据荧光恢复的速度可推算出膜蛋白或膜脂扩散速度。电镜与光镜的基本区别 显微镜显微镜分辨分辨本领本领光源光源透镜透镜真空真空成像原理成像原理LM200nm100nm可见光可见光（400-700nm） 紫外光紫外光（约（约200nm)玻璃透镜玻璃透镜玻璃透镜玻璃透镜不要求真空不
11、要求真空不要求真空不要求真空利用样品对光的利用样品对光的吸收形成明暗反吸收形成明暗反差和颜色变化差和颜色变化TEM0.2nm电子束电子束（0.01-0.9nm）电磁透镜电磁透镜要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用样品对电子利用样品对电子的散射和透射形的散射和透射形成明暗反差成明暗反差电镜与光镜光路图比较电子显微镜的基本构造 电子显微镜主要由4部分组成：电子束照明系统、成像系统、真空系统和记录系统。电镜图像的反差实质上是电子密度的差异，它是由于样品不同部分之间电子散射能力的差异所造成的。由于生物样品主要由C、N、O等元素构成，这些元素原子序数低，散射电子的能力较弱，因此需
12、要经过染色来增加样品的反差。利用重金属盐进行染色后，样品中的不同成分对各种“染料”有不同的亲和性，结合重金属较多的区域具有较强的电子散射能力，在电镜下呈现为黑色，反之亦然。细胞的精细结构保存完好；切片的厚度应在50nm左右，较薄的切片分辨率好，但反差较差，反之亦然；切片应耐受电子束的强烈轰击，包埋介质不发生变形或升华；切片应具有良好的反差切片均匀。 金属投影技术是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。由于投影时要求有一定的角度，朝向加热丝的一面被金属覆盖，而背向加热丝的样品面和背景则不能被金属覆盖。在电镜下观察时，被金属覆盖的很暗，而未被覆盖的则光亮。扫描电镜技术扫描电镜的原理
13、主要用来观察样品表面的形貌特征CO 2临界点干燥法解决引起样品变形的表面张力问题样品在观察前通常要喷镀一层金膜扫描电镜景深长，成像具有强烈的立体感。一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物用途：分离细胞器与生物大分子及其复合物差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与质脂等成分的显示方法 利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和相对含量。DNA特异性的显示方法多糖的显示方法脂类物质的显示细胞中各种酶的显示 DNA特异性的显示方法Feulg
14、en反应： 利用酸水解去除细胞中的RNA，仅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脱氧核糖核酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基与希夫试剂反应呈紫红色。多糖的显示方法PAS（过碘酸希夫氏）反应 利用过碘酸的强氧化作用破坏糖分子的CC键，使糖分子氧化产生双醛基，自由的醛基与希夫试剂作用形成紫红色产物。脂类物质的显示方法 对脂类物质的染色应用的是物理的扩散原理。苏丹类染料是脂溶性染剂，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，它会脱离酒精而溶于脂类结构中从而显色。细胞中各种酶的显示方法 由于酶易受外界条件影响而变性失活。因此对酶的显示一般采取间接的方法进行，对可以与酶发
15、生特异性结合的底物进行染色从而达到显示酶的目的。因此在实验的过程中需在尽量保持酶的活性。三、特异蛋白抗原的定位与定性利用免疫学方法进行胞内蛋白质定位 免疫荧光技术：快速、灵敏、特异性强，但其分辨率有限 免疫电镜技术：免疫酶标技术、免疫胶体金技术细胞外蛋白质的分析 蛋白电泳(SDS-PAGE) 免疫印迹反应(Western-Blot) 细胞内对于蛋白质分子的定位技术包括免疫荧光、免疫印迹以及免疫电镜等，这些技术都是将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术相结合用于研究特异蛋白抗原在细胞内的分布和定位。四、细胞内特异核酸序列的定位与定性 用标记的核酸探针通过分子杂交确定特异核苷酸序列在染色体
16、上或在细胞中的位置的方法称为原位杂交(in situ hybridization)。 把凝胶电泳分离开的DNA片段，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，做成一个凝胶的复制品，这个过程叫做印迹。将硝酸纤维素膜与带有放射性标记的探针杂交，通过放射自显影就可以辨认出与探针互补的特殊的核苷酸序列。 利用标记的DNA探针检测某一特定的DNA序列的方法称为Southern blot，检测特定RNA序列的方法称为Northern blot。五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态 利用放射性同位素电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl)的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一
17、种细胞化学技术。实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究步骤：同位素标记的生物大分子前体的掺入细胞内同位素所在位置的显示同位素标记的前体物在生物大分子合成过程中掺入细胞内即标记（标记：持续标记和脉冲标记）标记后的组织或细胞按常规方法制片在暗室中像样品表面均匀涂上一层乳胶，曝光、显影、定影后于显微镜下观察。细胞中银颗粒所在的部位既代表放射性同位素的标记部位六定量细胞化学分析技术流式细胞仪（Flow Cytometry） 用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。显微分光光度测
18、定技术（Microspectrophotometry） 利用细胞内某些物质对特异光谱吸收的原理，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括：紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法一、细胞培养动物细胞培养 细胞培养的概念和意义 原代培养细胞和传代培养细胞 动物细胞培养的基本过程 细胞系（cell line）和细胞株（cell strain）植物细胞培养：主要包括单倍体细胞培养（花药培养）和原生质体培养（体细胞培养）两种类型。非细胞体系在细胞生物学研究中的作用 来源于细胞，而不具有完整的细胞结构与成分，但包含了进行正常生物学反应所需要的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的
19、体系即为非细胞体系（cell-free system) 动物细胞培养的基本过程取材 分离细胞（酶解或螯合剂） 选择相同类型的细胞 贴壁培养 ：体外培养的细胞呈成纤维样细胞与上皮样细胞两种基本形态； 传代细胞培养的概念和意义细胞培养：将动、植物细胞或组织从机体内取出分散成单细胞悬液，给予必要的生长条件，让其在培养基上继续生长繁殖的过程。细胞培养的意义 可以在离体条件下观察研究细胞生命活动的规律； 观察细胞对于各种生物活性物质的反应； 通过细胞培养可以获得大量性状相同的细胞，是一种良好的实验材料； 细胞在体外环境的局限性，又使细胞的形态与功能不能与体内的同类型细胞完全等同。原代细胞（primary
20、 culture cell）：从机体取出后立即培养的细胞。传代细胞（sub-culture cell）：原代培养的细胞在生长一定时间后，由于营养成分的消耗、代谢产物的积累以及接触抑制等因素而停止生长，因此必须将细胞传到新的培养基中使其继续生长。动物细胞培养的条件 物质营养：氨基酸、维生素、微量元素和血清； 环境因素：无菌环境、合适的温度、一定的渗透压和气体环境、O2和CO2。后者对于维持细胞培养液的酸碱度十分重要； 代谢物和废物的排除细胞系细胞系：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(cell line)。如果不能继续传代，或传代次数有限，可称为有限细胞系(finite cell line)；
21、如可连续培养，则称为连续细胞系(continuous cell line)。连续细胞系的特点是染色体明显变化，一般呈亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制和容易传代等特性。实验室中常用的细胞系细胞克隆：用单细胞克隆培养或通过药物筛选的方法从某一细胞系中分离出单个细胞，并由此增殖形成的，具有基本相同的遗传性状的细胞群体称为细胞克隆。细胞株细胞株：通过细胞克隆方法得到细胞群体经过生物学鉴定，如具有特殊的遗传标记或性质，这样的细胞系称为细胞株。名称类型来源3T3成纤维细胞小鼠Hela宫颈癌上皮细胞Henrittal LacksBHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtK1上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细
22、胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP2/0骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠实验室中几种常用的细胞系 二、细胞工程 细胞工程是一种在细胞水平上运用细胞生物学和分子生物学的方法改变生物遗传性状的生物工程。主要包括细胞融合、细胞生物反应器、细胞器移植基因转移和细胞培养等。细胞融合(fusion)与细胞杂交(hybridization)技术单克隆抗体（monoclone antibody）技术 细胞拆合与显微操作技术转基因生物和基因敲除细胞拆合是把细胞核与细胞质分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相互结合，形成核质杂交细胞。细胞拆合分为物理法和化学法两种。一个生物体如果被导入了一个新基因，或它的基因组
23、被重组DNA技术等其它方法所改变，就称为转基因生物。转基因生物 一个有功能的基因通过基因工程方法完全被剔除的人工突变技术称为基因敲除。这项技术是Capecchi于20世纪80年代末在Uath大学发展起来的，实验的动物通常是小鼠。实验分三步：构建重组体、转基因敲除和筛选。 取材取材 固定固定 冲洗冲洗 脱水脱水 透明透明 包埋包埋 切片切片 老化老化 脱蜡脱蜡 复水复水 染色染色 透明透明 镜检镜检激发光滤片：光源和样品之间；双色分光镜；激发光阻断滤片：物镜和目镜之间。右图所示为荧光显微镜下观察到的小肠微绒毛的图像。 利用Evans蓝进行染色，这种染料在紫外光的激发下可发出红色荧光。黄绿色的荧光
24、是GLT2（一种葡萄糖转移蛋白）荧光标记抗体的染色。利用不同的显微镜所观察的体外培养细胞骨骼肌细胞放大4500倍。左图切片厚度为1m；右图切片厚度为0.025m。 负染色技术电镜负染技术是用重金属盐对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一薄层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。这样在图像中背景是黑暗的，而未被包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染。是观察病毒、核糖体等颗粒性样品的常用技术。 电子束被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，电子束可激发样品表面放出二次电子，二次电子由探测器收集，并被闪烁器转变成光信号，再经光电倍增管和放大器又转变成电压信号来控
25、制荧光屏上电子束的强度。密度梯度离心通过重力或离心力的作用使样品中不同组分以不同的沉降率沉降，形成不同的沉降带。各组分的沉降率与它们的形状和大小有关，通常以沉降系数（S值）表示。速度沉降主要用于分离密度相近而大小不一的细胞组分。等密度沉降用于分离不同密度的细胞组分。单克隆抗体（McAb)是指在B淋巴细胞系中的每一个细胞，只能产生一种它所专一的、针对一种它能识别的抗原决定簇的抗体。HAT选择培养基在有甘氨酸合成嘌呤碱基过程中有二个反应步骤需要四氢叶酸作为辅酶参与反应；而胸腺嘧啶碱基合成中，也需要四氢叶酸参与反应。四氢叶酸的类似物氨基喋呤可阻断细胞中嘌呤和胸腺嘧啶碱基的合成，进而就阻断了RNA和D
26、NA合成。细胞中还存在补救途径：1）在HGPRT存在下，次黄嘌呤（或鸟嘌呤）可以被合成出次黄嘌呤核苷酸（或鸟嘌呤核苷酸）。2）胸腺嘧啶核苷在TK催化下可以与ATP反应合成胸腺嘧啶核苷酸基因组很小，很适合遗传操作；作为外源基因的载体，向一些细胞中转染特定的基因，以用于蛋白质功能的研究以及肿瘤的基因治疗。 细菌培养方便，生长快，基因结构简单（大肠杆菌环状DNA由4.2103kb，编码4288个基因），突变株的诱变和分离、鉴定容易，转基因技术成熟，进行基因定位简便易行。酵母是单细胞真核生物，生长迅速并且易于遗传操作，其基因组含1.2104kb，约有5900个基因；构建酵母人工染色体用于大片段DNA序
27、列的克隆和分析；庞大的酵母基因突变库为各种细胞生命活动（如细胞分裂周期调控）的研究提供了非常重要的研究材料。 拟南芥是一种十字花科的被子植物，具有个体小、生长周期快、种子多和生活力强等优点。有五对染色体，共有1.42106kb，约有25000个基因,是目前已知最小的植物基因组。 线虫的基因组, 1105kb ，约含19099个基因。成体长仅1mm，由959个细胞组成，生命周期为3天，繁殖快，在显微镜下通体透明，体内每一个细胞的形成都 可以被追踪。属小型脊椎动物，基因数目大约30000个，与人类的相近，它的许多基因与人类的基因存在一一对应的关系；透明的鱼卵和胚胎使对其胚胎发育过程中细胞行为的观察
28、与研究极为便利。 果蝇的基因组1.2105kb，约含13600个基因。果蝇基因组中许多基因在进化上很保守，与人类基因有很高的同源性。 小型哺乳动物，在进化方面是最接近人类的， 其基因组全长3.0106个kb，约含30000个基因，人们已经建立了近千个小鼠品系。金颗粒容易识别，具有很高的分辨率。可以制成不同直径大小的金颗粒，用以双重标记或多重标记。既可用于超薄切片，也可用于组装制备的骨架成分和膜系统蛋白成分的标记。 Hela细胞 CHO细胞细胞融合 细胞融合是指自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合，
29、最终形成单核的杂种细胞。The Nobel Prize in Chemistry 2008 “for the discovery and development of green fluorescent protein, GFP” Osamu Shimomura (下村修）：1962年在多管水母中发现了发光蛋白“水母素”和副产物GFP。Martin Chalfie（马丁查尔菲）：证明GFP可以在细菌和线虫中表达，并可以发出荧光。Roger Y.Tsien（钱勇键） GFP的发光基团通过分子生物学的技术改变一下，就可以改变它的发光特性。Douglas prasher (道格拉斯普莱舍）：将GFP应用在 细胞生物学中，用于跟踪基因的表达和蛋白的定位，并于1992年得到了GFP的全序列。
