第六章 发酵液的预处理及固液分离.

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1、第六章发酵液的预处理及第六章发酵液的预处理及固液分离固液分离四川理工生药2011抗生素下游加工的一般过程抗生素下游加工的一般过程1、发酵液的预处理和固液分离、发酵液的预处理和固液分离2、提取：沉淀、吸附、萃取、提取：沉淀、吸附、萃取3、分离（精制：层析、离子交换）、分离（精制：层析、离子交换）4、最后纯化（成品加工：浓缩、结晶、干燥）、最后纯化（成品加工：浓缩、结晶、干燥）第一节发酵液的性质第一节发酵液的性质一、抗生素在发酵液中的存在部位一、抗生素在发酵液中的存在部位存在部位存在部位.细胞内：积累于菌丝体内，且水细胞内：积累于菌丝体内，且水溶性小（少数）溶性小（少数）.细胞外：产生后被分泌到细

2、胞外细胞外：产生后被分泌到细胞外（多数）（多数）胞内抗生素：胞内抗生素：过滤过滤 滤饼滤饼提取提取加酸、碱等使其转入细胞外加酸、碱等使其转入细胞外二、抗生素的稳定性二、抗生素的稳定性抗生素需在适宜的温度、抗生素需在适宜的温度、pH值、压力等值、压力等条件下才稳定。提取、分离等过程应提供适条件下才稳定。提取、分离等过程应提供适宜的条件。宜的条件。eg.青霉素青霉素 pH值值4.8-5.2，低温条件下，低温条件下才稳定才稳定三、发酵液中的杂质三、发酵液中的杂质较多包括：较多包括：.可溶性：可溶性：Pr. aa. 金属离子等金属离子等萃取，分离，离子交换萃取，分离，离子交换.不溶性：菌丝体、剩余培养

3、基等不溶性：菌丝体、剩余培养基等过滤除去过滤除去第二节发酵液预处理的方法第二节发酵液预处理的方法一、发酵液预处理的目的一、发酵液预处理的目的、固液分离：分离菌丝体、未用完培养基及其它、固液分离：分离菌丝体、未用完培养基及其它代谢产物等，尽可能使发酵产物转入后续工序处代谢产物等，尽可能使发酵产物转入后续工序处理的相中（多为液相）理的相中（多为液相）、能够除去部分杂质：主要去除蛋白质和金属离、能够除去部分杂质：主要去除蛋白质和金属离子，减少后续处理的负荷。子，减少后续处理的负荷。二、二、发酵液预处理的要求发酵液预处理的要求1、菌体分离、菌体分离 发酵液中除发酵产物外，还含有大量的菌体，发酵液中除发

4、酵产物外，还含有大量的菌体，为方便提取和精制，首先要将菌体与发酵液分为方便提取和精制，首先要将菌体与发酵液分离。离。 为保证离心和过滤顺利进行，要正确控制发为保证离心和过滤顺利进行，要正确控制发酵终点。否则对目标物的回收均不利。酵终点。否则对目标物的回收均不利。、蛋白质的去除、蛋白质的去除 发酵液中去除菌体和固体悬浮物后，一些发酵液中去除菌体和固体悬浮物后，一些可溶性蛋白质仍留在滤液中，需设法去除。可溶性蛋白质仍留在滤液中，需设法去除。 除去蛋白质的滤液要保证在一定的除去蛋白质的滤液要保证在一定的pH 范围范围内不发生混浊，否则影响溶媒提取和离子交换内不发生混浊，否则影响溶媒提取和离子交换提取

5、。提取。 、重金属离子的去除、重金属离子的去除 重金属离子的存在，会影响提取和精制，重金属离子的存在，会影响提取和精制，同时会影响发酵产物的质量和回收率，故必须同时会影响发酵产物的质量和回收率，故必须除去。除去。、色素、热原质、毒性物质的去除、色素、热原质、毒性物质的去除 针对药用发酵产品尤为重要。尤其是针剂。针对药用发酵产品尤为重要。尤其是针剂。、改变发酵液性质，以利于提取和精制后续、改变发酵液性质，以利于提取和精制后续工序的操作顺利进行工序的操作顺利进行 如，当发酵终了时，发酵产物可能在发酵如，当发酵终了时，发酵产物可能在发酵液中，也可以在菌体内部或两相同时存在。液中，也可以在菌体内部或两

6、相同时存在。常采用调节常采用调节pH、酸性或碱性的方法使发酵产、酸性或碱性的方法使发酵产物转入后续处理的相中。物转入后续处理的相中。、调整适当、调整适当pH值和温度值和温度 避免引起产物的破坏和损失。多数抗生素避免引起产物的破坏和损失。多数抗生素不耐热，对不耐热，对pH值要求高。值要求高。三、蛋白质的预处理（除杂蛋白）三、蛋白质的预处理（除杂蛋白）1等电点沉淀等电点沉淀 2. 变性沉淀变性沉淀 3加各种沉淀剂沉淀加各种沉淀剂沉淀 4加入凝聚剂（金属盐）加入凝聚剂（金属盐） 5加入絮凝剂加入絮凝剂 1等电点沉淀等电点沉淀 调调Ph到等电点，杂蛋白的到等电点，杂蛋白的净电荷为零，溶解净电荷为零，溶

7、解度最小，沉淀析出。度最小，沉淀析出。多数抗生素发酵液的等电点多数抗生素发酵液的等电点4.0-5.5之间，之间，一般加酸调。如：硫酸、盐酸、磷酸等。一般加酸调。如：硫酸、盐酸、磷酸等。2. 变性沉淀（凝固）：变性沉淀（凝固）：加热，但多数抗生素不耐热，只适用于热稳定加热，但多数抗生素不耐热，只适用于热稳定抗生素。如：灰黄霉素抗生素。如：灰黄霉素加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等3加沉淀剂沉淀：加沉淀剂沉淀： n对酸性发酵液：可加阴离子，如三氯乙酸，对酸性发酵液：可加阴离子，如三氯乙酸，鞣酸等鞣酸等n对碱性发酵液：可加阳离子，如对碱性发酵液：可加阳离子，如A

8、g+、Cu2+、Zn2+等等4加入凝聚剂（金属盐）加入凝聚剂（金属盐） n凝集剂的作用：粒子表面电荷中和；消除凝集剂的作用：粒子表面电荷中和；消除粒子表面稳定的双电荷层；使胶体粒子的粒子表面稳定的双电荷层；使胶体粒子的排斥电位降低而发生聚沉。排斥电位降低而发生聚沉。n金属盐特别是重金属盐较常用。如，硫酸金属盐特别是重金属盐较常用。如，硫酸铝、三氯化铁等铝、三氯化铁等5加入絮凝剂加入絮凝剂 n絮凝絮凝是指某些高分子絮凝剂能在悬浮是指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团的过程粗大絮凝团的过程。n近年较常用。如，壳聚糖、海藻酸钠、近年较常

9、用。如，壳聚糖、海藻酸钠、明胶的等（带有氨基、羧酸基等，电明胶的等（带有氨基、羧酸基等，电荷密度高。荷密度高。5加入絮凝剂加入絮凝剂 n絮凝絮凝是指某些高分子絮凝剂能在悬浮是指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团的过程粗大絮凝团的过程。n近年较常用。如，壳聚糖、海藻酸钠、近年较常用。如，壳聚糖、海藻酸钠、明胶的等（带有氨基、羧酸基等，电明胶的等（带有氨基、羧酸基等，电荷密度高。荷密度高。四、高价金属离子的去除四、高价金属离子的去除Ca2+：加入草酸钠或草酸，生成的草酸钙沉淀还能促使加入草酸钠或草酸，生成的草酸钙沉淀还能促使杂蛋白质凝

10、固，提高滤速和滤液质量。杂蛋白质凝固，提高滤速和滤液质量。 Mg2+：草酸、草酸、 磷酸盐（在碱性条件下，生成磷酸镁盐沉磷酸盐（在碱性条件下，生成磷酸镁盐沉淀）、三聚磷酸钠。淀）、三聚磷酸钠。nFe3+：n加入黄血盐，形成普鲁士蓝沉淀。第三节发酵液的液固分离第三节发酵液的液固分离一、固液分离的目的一、固液分离的目的n收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相（胞内抗生素）（胞内抗生素）n收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物如，细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物如，细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和它们的絮凝体等

11、。和它们的絮凝体等。 （胞外抗生素）（胞外抗生素）二、固液分离的要求二、固液分离的要求n滤液澄清滤液澄清便于后续处理便于后续处理n速度快多数抗生素不稳定速度快多数抗生素不稳定三、影响固液分离的因素三、影响固液分离的因素、微生物的种类：、微生物的种类： 真菌：比较粗大真菌：比较粗大, ,易过滤分离易过滤分离, ,通常不需特殊处理通常不需特殊处理 放线菌放线菌: :细而分枝细而分枝(1um),(1um),较黏较黏, ,较难较难. .需处理需处理加加 助滤剂或蛋白絮凝剂助滤剂或蛋白絮凝剂 细菌细菌: :体积细小体积细小, ,过滤最难过滤最难, ,可考虑离心可考虑离心、菌体细胞、菌体细胞: :通常细胞