蛋白质含量的测定

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1、林琳林琳蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定基于蛋白质的基于蛋白质的元素组成特点元素组成特点基于蛋白质的基于蛋白质的化学显色反应化学显色反应基于蛋白质的基于蛋白质的光吸收特性光吸收特性选择测定选择测定方法主要基于几点考虑方法主要基于几点考虑：实验对测定所要求实验对测定所要求的灵敏度和精确度的灵敏度和精确度检测条件检测条件溶液中存在溶液中存在的干扰物质的干扰物质蛋白质特点蛋白质特点测定所要花测定所要花费的时间等费的时间等在选择方法时应考虑在选择方法时应考虑【实验目的】【实验目的】 1. 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理原理 2. 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含

2、量的实验掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术和使用方法技术和使用方法。紫外分光光度法测定蛋白质含量紫外分光光度法测定蛋白质含量【实验原理】【实验原理】 蛋白质中蛋白质中酪氨酸酪氨酸、色氨酸色氨酸和苯丙氨酸和苯丙氨酸残基残基的苯的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在280nm具有一具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内内（0.1-10mg/mL），蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，因此可作蛋白质定量分析。度与其浓度成正比，因此可作蛋白质定量分析。TyrTrpPhe【仪器与试剂

3、】【仪器与试剂】 1.1.紫外分光光度计，紫外分光光度计，比色皿比色皿，吸量，吸量管。管。 2. 2.标准蛋白质溶液：标准蛋白质溶液：0.9% NaCl0.9% NaCl溶液溶液溶解溶解0.25g0.25g结晶牛结晶牛血清蛋白血清蛋白，稀释到，稀释到250ml250ml。 3. 3.待测蛋白溶液：用酪蛋白配制，浓待测蛋白溶液：用酪蛋白配制，浓度在度在1.0-2.5mg/ml1.0-2.5mg/ml 4.0.9% NaCl 4.0.9% NaCl溶液溶液 5. 5.试管试管1.5cm1.5cm15cm15cm（9 9） 6. 6.移液管移液管1ml1ml（3 3），），2ml2ml（2 2），）

4、，5ml5ml（2 2）。）。【实验步骤】【实验步骤】项 目12345678标准蛋白液/ml00.51.01.52.02.53.04.0蒸馏水/ml4.03.53.02.52.01.51.00蛋白质浓度/ml00.1250.250.3750.500.6250.751.0A280表表1-2 1-2 紫外分光光度法测定蛋白质浓度紫外分光光度法测定蛋白质浓度-标准曲线的绘制标准曲线的绘制 1 1、标准曲线、标准曲线法法（1 1）标准曲线的制作：取）标准曲线的制作：取8 8只试管按表只试管按表1-21-2加入试剂，摇匀。选择加入试剂，摇匀。选择光程光程1cm 1cm 石英比色皿，在石英比色皿，在280

5、nm280nm波长测定波长测定A280A280，以，以A280A280值为纵坐标，值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。（2 2）样品测定：）样品测定： 配制待测蛋白质溶液配制待测蛋白质溶液1ml1ml，加入蒸馏水，加入蒸馏水3ml3ml，摇匀，摇匀，测定测定A280A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度，从标准曲线中查出蛋白质浓度。吸吸光光度度蛋白质浓度蛋白质浓度 简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用 低浓度的盐低浓度的盐(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 等和大多数缓冲液不干扰测定

6、等和大多数缓冲液不干扰测定 紫紫外吸收法的外吸收法的缺点：缺点：紫外吸收法的优点：紫外吸收法的优点： 测定测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多 在在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差 附注附注对于有核酸存在时所造成的误差，可将待测的蛋白质溶液稀对于有核酸存在时所造成的误差，可将待测的蛋白质溶液稀释至光密度在释至光密度在0.22.00.22.0之间，选用光程为之间，选用光程为1cm1cm的石英比色杯，的石