第四章 细胞培养与代谢调控.

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1、第四章 细胞培养与代谢调控生物科学与技术学院动物的细胞培养是指从活的机体中取出细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。从生物体内取出细胞，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法 。将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。第一节第一节 细胞培养细胞培养体外细胞培养物的生长类型体外细胞培养物的生长类型 按生长方式划分：按生长方式划分：1 1、粘附型、粘附型细胞细胞: :也叫贴壁型，附着

2、在某一固相支持物表面才能生长的细胞。也叫贴壁型，附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。2 2、悬浮型、悬浮型细胞细胞: :不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。3 3、半贴壁型、半贴壁型细胞：细胞可在悬浮状态生长，也可以在一定条件下贴壁生长。细胞：细胞可在悬浮状态生长，也可以在一定条件下贴壁生长。p 基本上植物细胞都是悬浮型细胞培养方式，动物细胞是粘附型细胞培养方式。基本上植物细胞都是悬浮型细胞培养方式，动物细胞是粘附型细胞培养方式。 p 绝大多数动物细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮绝大

3、多数动物细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。状态下生长。细胞贴壁过程细胞贴壁过程p贴附贴附p接触抑制接触抑制p密度抑制密度抑制细胞呈贴壁生长细胞呈贴壁生长, ,梭形或不规则形梭形或不规则形, , 在粘附因在粘附因子的作用下，细胞生出伪足，伪足越多，贴壁子的作用下，细胞生出伪足，伪足越多，贴壁越好。越好。细胞在生长过程中达到相互接触时停止分细胞在生长过程中达到相互接触时停止分裂的现象。因此，贴壁细胞通常都是单层裂的现象。因此，贴壁细胞通常都是单层细胞培养状态。细胞培养状态。细胞接触后，虽发生接触抑制，但只要营细胞接触后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，细胞

4、仍会增殖分裂，细胞数量仍养充分，细胞仍会增殖分裂，细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，液中营养成分减少， 代谢产物增多时，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。生密度抑制，导致细胞分裂停止。粘附型细胞分为：粘附型细胞分为：1 1、成纤维细胞型：、成纤维细胞型：似体内成纤维细胞的形态，似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2323个长短不等的突起，个长短不等的突起，中有卵圆形核。生长时中有卵圆形核

5、。生长时排列成放射状，漩涡状排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连并不紧靠连成片成片，细胞，细胞细胞接触易断开而细胞接触易断开而单独行动，单独行动，游离的游离的单独的单独的成纤维样细胞，常有几个成纤维样细胞，常有几个伸伸长的细胞突起。长的细胞突起。2 2、上皮型细胞：、上皮型细胞：类似类似体内的体内的上皮细胞上皮细胞，扁平扁平，不规则多角形不规则多角形，中有圆形核。，中有圆形核。生长时生长时易相易相连连成片，成片，相靠相靠紧密相连紧密相连成薄层成薄层铺石状生长铺石状生长时呈时呈膜状膜状移动，移动，很少很少脱离细胞群而脱离细胞群而单单个活动。个活动。3 3、游走细胞型：、游走细胞型：呈散在生长，一般不

6、连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。4 4、多形型细胞：、多形型细胞：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。 细胞培养的条件细胞培养的条件1 1、无菌、无毒：、无菌、无毒：（1）对培养液和所有用具进行无菌处理）对培养液和所有用具进行无菌处理（2 2）添加一定量的抗生素，防治培养过程中的污染）添加一定量的抗生素，防治培养过程中的污染（3

7、 3）定期更换培养液，以便清除代谢产物防治细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害）定期更换培养液，以便清除代谢产物防治细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害2 2、全部的营养物质：、全部的营养物质：葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素、葡萄糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素、动物血清动物血清等。等。3 3、适宜的温度和、适宜的温度和PHPH值：值： 36.5+0.536.5+0.5度度, , PHPH值值7.2-7.47.2-7.44 4、必要的气体条件：、必要的气体条件：O O2 2 ：细胞代谢所必需的：细胞代谢所必需的COCO2 2：维持培养液的维持培养液的PHPH通常采用培养皿或松

8、盖培养瓶将其置于含通常采用培养皿或松盖培养瓶将其置于含95%95%空气和空气和5%CO5%CO2 2的培养箱中进行培养的培养箱中进行培养5 5、其他：、其他：光照、湿度等光照、湿度等细胞培养的方式细胞培养的方式根据细胞生长方式细胞生长方式分为贴壁培养贴壁培养和悬浮培养悬浮培养两大类；根据细胞代次细胞代次分为原代培养原代培养和传代培养传代培养；根据细胞培养操作方式分为：根据细胞培养操作方式分为：1 1、固定化培养：、固定化培养：通过一些固相的交联化合物将细胞固定于小格中，或者通过共价键交联住细胞，在培养基中进行培养。2 2、分批培养：、分批培养：将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞

9、不断增长，产物不断形成和积累，最后将培养基连同细胞一并取出，培养结束。最后将培养基连同细胞一并取出，培养结束。3 3、流加培养：在分批培养的基础上间断地或连续地补加培养基。、流加培养：在分批培养的基础上间断地或连续地补加培养基。4 4、半连续培养：、半连续培养：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每每间隔一段时间，取出部分培养物或细胞，然后补充同样数量的新鲜培养基，继续培养。间隔一段时间，取出部分培养物或细胞，然后补充同样数量的新鲜培养基，继续培养。5 5、连续培养：连续性加入新鲜的培养基，同时取出相同量的旧培养基和细胞。、连续培养：连续性加入新鲜的培养基，同时取出相同

10、量的旧培养基和细胞。6 6、灌流培养：、灌流培养：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。通常用于被固定后的细胞培养。地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。通常用于被固定后的细胞培养。原代培养：原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1 1代细胞与传代细胞与传1010代以内的代以内的细胞称为原代细胞培养。细胞称为原代细胞培养。传代培养：传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细

11、胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。培养瓶中继续培养，称为传代培养。特殊的概念：特殊的概念：永生化细胞：永生化细胞：正常细胞的生长代谢处于增殖、分化、衰老及凋亡的动态平衡，体外增殖是有限的，培养细胞生命的自然极限称为海弗利克极限。细胞内控制这一系列过程的是一个庞大复杂的细胞调节网络，其中任何一个环节发生错误，都有可能触发细胞内相互关联的一系列信号分子的表达和功能异常，使细胞跨越海弗利克极限，获得不死性，发生永生化。细胞系：细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。无限细胞系：无限细胞系：细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无